基質金屬蛋白酶抑制劑在糖尿病視網膜病變的研究進展

朱素華，徐圣秋

(徐州市第一人民醫院 藥學部，江蘇 徐州 221000)

糖尿病是世界上常見的代謝性疾病之一，對人類的健康產生了重大威脅，預計到2045年全球20～79歲人群中有7.83億人患病[1]。糖尿病并發癥較多，包括微血管并發癥和大血管并發癥，其中微血管并發癥包括糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy，DR)、糖尿病腎病、糖尿病性神經病變，大血管并發癥包括缺血性心臟病、周圍血管病、腦血管疾病[2]。

DR是糖尿病嚴重的微血管并發癥之一，全世界范圍內約有420萬患者因此失明，且人數在逐年增加[3]。氧化應激、炎癥、遺傳因素、晚期糖基化終產物形成增多、多元醇途徑的激活和蛋白激酶C可能在DR的發病機制中發揮著重要作用，但是確切的機制尚不清楚[4-5]。在增殖期，上述機制均可引起血管通透性增加、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)分泌增多[6-7]。視網膜、視神經和虹膜上新生血管生成，新生血管較脆，易發生視網膜出血。此外，滲漏導致的視網膜下間隙積液可能導致黃斑水腫，進而引起視網膜脫離。

基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是鋅依賴性的明膠酶，在細胞外基質中被激活，從而水解大部分細胞外基質蛋白酶[8-9]。多數MMPs由非活性的酶原分泌，然后被纖溶酶切割成活性形式[10]。盡管早在20世紀60年代人們就開始研究MMPs在細胞外基質中的蛋白水解活性[11]，但近年來，世界范圍內的許多醫學研究者才開始對MMPs的研究越來越重視。事實上，除了降解各種細胞外蛋白，MMPs還能在外界環境刺激下激活和抑制信號通路相關分子的表達，導致細胞內的變化。其中一些還參與各種激素和信號分子的激活和失活。盡管如此，MMPs的作用逐漸被發現，被證明與癌癥、動脈粥樣硬化、炎癥性腸病、阿爾茨海默病、衰老及DR有關[12-15]。MMPs的具體功能一直備受關注，在DR中的具體機制有待進一步研究。本文通過對MMPs在DR中的研究現狀、 MMPs種類、針對MMPs靶點的新療法進行綜述，旨在為以MMPs為靶點的DR新療法在臨床上的應用提供依據。

1 MMPs在DR中的研究現狀

在DR中，MMPs的平衡遭到破壞[16]。由于MMPs是細胞外基質降解的主要決定因素，它們在視網膜病變中的作用是非常重要的。MMPs通過降解維持血視網膜屏障(blood retinal barrier，BRB)完整性的連接蛋白、緊密連接蛋白、鈣粘著蛋白來增加血管通透性。MMP-2和MMP-9因能夠降解基底膜，一直備受關注。此外，它們在新生血管形成中也起著重要作用。研究發現，在糖尿病大鼠造模12周時，視網膜組織中MMP-9、MMP-2、MMP-14 mRNA水平升高，在高糖環境刺激下，視網膜內皮細胞MMP-9表達增加[17]。Liu等[18]進一步研究發現，糖尿病動物視網膜組織中MMP-2和MMP-9表達增加。此外，他們還證實BB-94(一種TIMPs )能夠有效抑制視網膜血管通透性，證實MMP在BRB中發揮著重要作用。Gaonkar等[19]在增殖性糖尿病視網膜病變(proliferative diabetic retinopathy，PDR)患者的玻璃體中檢測出MMP-9，可能與玻璃體出血有關。隨后，有研究報道MMP-9的調節依賴于血管緊張素Ⅱ和VEGF[20]。因此，PDR視網膜中ACE依賴性血管緊張素II和VEGF的生成可能與MMP-9濃度的升高有關。進一步研究表明，MMP-9在細胞凋亡中發揮重要作用，刺激細胞VEGF的分泌[7]，研究者還發現在PDR患者中，MMP-9活性增加可能導致組織因子途徑抑制物(tissue factor pathway inhibitor，TFPI)表達降低。根據動物研究數據，TFPI可能抑制血管生成[7]。2018年，Abu El-Asrar等[21]再次證明PDR患者玻璃體內MMP-9與VEGF呈正相關，同時研究了4種金屬蛋白酶組織抑制劑(tissue inhibitors of metalloproteinases，TIMPs)的表達情況，結果發現，在PDR患者玻璃體內TIMP-1和TIMP-4水平升高，并與MMP-9和VEGF水平呈正相關。此外，Abu EI-Asrar等[22]在PDR患者的玻璃體標本中發現了MMP-1；相反，在正常人樣本中沒有發現MMP-1。玻璃體內MMP-1與VEGF水平呈正相關。這表明凝血酶/MMP-1/蛋白酶活化受體-1通路可能參與缺血誘導PDR的血管生成。因此，深入了解TIMPs的作用對于研究以MMPs和TIMPs為靶點的新藥物必不可少。

2 TIMPs種類

TIMPs作為一種內源性抑制劑，能夠以特定的方式與MMPs結合，抑制MMPs的活化。到目前為止，已經發現4種TIMPs，分別是TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3和TIMP-4[23]。所有的TIMPs具有相似的功能，但也存在一些特異性差異。TIMP-2對MMP-2的抑制作用是TIMP-1的2～10倍。然而，與TIMP-2和TIMP- 3不同的是，TIMP-1不能有效降解膜型MMPs(MT-MMPs)。TIMPs以1∶1的比例與相應的MMPs結合，因此MMPs和TIMPs濃度間的平衡在不同疾病中需要精確調節[23]。對于慢性炎癥，糖尿病患者血漿和組織樣本中的MMPs濃度可能更高。MMPs和TIMPs濃度并不一致[21, 24]。在大多數情況下MMP/TIMP比例升高[25-26]。此現象發生在各種病理狀態下，包括慢性糖尿病并發癥[24]。另一方面，當患者伴有糖尿病并發癥時，MMP活性增加。這種情況出現在糖尿病腎病可能與TIMP-2活性相關的糖基化水平的升高有關。

目前，研究最廣泛的是TIMP-1，TIMP-1可能預防1型糖尿病的發生。與之相對應的動物研究發現，糖尿病小豬血漿中TIMP-1的升高與其心臟纖維化、左心室肥厚增加及心臟功能障礙密切相關[27]。TIMP-1抑制MMP-9活性，引起細胞毒性T細胞遷移到胰島中的細胞減少，進而減少細胞凋亡，這可能是未來糖尿病具有潛力的治療靶點之一。

3 針對MMPs靶點的新療法

3.1目前DR的治療方法 由于DR是糖尿病的一個重要并發癥，且危害巨大，因此早期診斷和治療顯得十分重要。目前DR的治療手段有：①玻璃體內注射抗VEGF藥物(如雷珠單抗、康柏西普、阿柏西普、貝伐珠單抗)、抗炎藥皮質類固醇(如曲安奈德、地塞米松緩釋劑)，傳統的激光光凝術和新型掃描式光凝治療；②其他治療藥物：心磷脂靶向肽、α-硫辛酸、葉黃素、達普拉締等。上述治療方法效果比較肯定，可作為評價其他治療方法有效性的參考[28]。然而這些治療方法具有一定的局限性，尋求新的替代治療十分必要[29]。

3.2TIMPs 現在大部分國內外研究主要針對與視力損害有關的糖尿病性黃斑水腫和PDR。目前最常見的研究靶點是MMP-2、MMP-9和VEGF，因為它們在視網膜病變的發展中起著至關重要的作用。歷史上第一個人工合成的TIMPs被用于治療癌癥。早在20世紀90年代研究者就發現腫瘤生長、血管再生與MMPs表達有重要聯系。TIMPs被認為是治療癌癥的一個重大突破，然而TIMPs可能會對正常組織中的MMP發揮作用。此外這些藥物的生物利用度低、不良反應大，在臨床靶向治療癌癥的使用中受到限制。但是相關研究還在繼續，研究者們正在關注下一代新型TIMPs和其他疾病。

2002年，一種新型的選擇性MMP-9和MMP-2抑制劑普馬司他(AG3340)被證實在動物模型中能夠顯著抑制氧化應激進而減少視網膜新生血管形成，可能是治療DR的潛在藥物[30]。2007年，Barnett等[31]在氧誘導視網膜病變的動物模型上檢測了3種具有不同選擇性的TIMPs：RO-31-9790(廣譜抑制劑)、AG3340(選擇性MMP-2和MMP-9抑制劑)和DPC-A37668(選擇性MMP-2抑制劑)。所有藥物均經玻璃體腔注射給藥，AG3340和DPC-A37668也經口服和腹腔給藥。玻璃體內注射這3種藥物后新生血管形成的面積均減少，但只有注射RO-31-9790的動物模型新生血管生成面積減少顯著。其他藥物抗血管生成的作用可能與注射造成的傷口愈合有關。與對照組相比，DPC-A37668確實使新生血管生成顯著減少，但僅在口服時效果顯著。DPC-A37668是所有實驗抑制劑中最有潛力的藥物，因為它的給藥途徑風險最小。Bhatt等[32]研究發現，阿司匹林(一種非選擇性COX抑制劑)能增強米諾環素抑制MMP-2和MMP-9的作用。

3.3MMPs的轉錄調節因子 早期的研究主要集中在與MMP活性位點結合的螯合鋅離子的抑制劑上[33]。現在，研究者逐漸開始研究其他更復雜的調節MMPs表達的方法。2013年，一個研究小組試圖檢測細胞外信號調節激酶-1/2(extracellular regulated protein kinase 1/2，ERK1/2)抑制劑(U0126)對糖尿病大鼠視網膜MMP-9和TIMP-1表達的影響。研究者在實驗中采用鏈脲佐菌素(STZ)造模，將動物分為3組：正常組、未注射抑制劑的糖尿病組和注射U0126的糖尿病組。與正常組相比，未注射抑制劑的糖尿病組視網膜組織ERK1/2活性和MMP-9表達顯著升高，TIMP-1表達降低；與未注射抑制劑的糖尿病組相比注射U0126的糖尿病組ERK1/2活性和MMP-9表達均降低，同時TIMP-1水平升高；注射U0126的糖尿病組與正常組實驗結果相似[34]。

另一方面，Mishra等[35]研究了聚ADP核糖聚合酶-1對調節MMP-9基因表達的轉錄因子的影響。聚ADP核糖聚合酶-1與相應的轉錄因子結合，促進轉錄過程。聚ADP核糖聚合酶-1活性的增加與MMP-9水平的升高和細胞損傷有關。在細胞實驗中，與正常糖培養的細胞組相比，高糖刺激組細胞MMP-9表達和聚ADP核糖聚合酶-1活性明顯升高，在給與聚ADP核糖聚合酶-1抑制劑的高糖細胞組沒有出現這種現象，這一實驗結果在小鼠實驗中也得到證實。因此，轉錄調節因子聚ADP核糖聚合酶-1抑制劑為DR的治療提供了新方向。

3.4植物性天然化合物 研究表明一些天然和植物性物質可調節MMPs活性。Olanlokun等[36]對姜黃中提取的姜黃素進行了研究分析，發現姜黃素能夠調節MMPs活性，但姜黃素具有非特異性，生物利用度低。然而未來可能可以把姜黃素設計成選擇性高和生物利用度更高的藥物。Alparslan等[37]對從蜂膠中提取的咖啡酸苯乙酯(caffeic acid phenethyl ester，CAPE)進行了研究，與模型組相比，CAPE治療組MMP-2、MMP-9的表達水平降低、氧化應激損傷減少。陳晶等[38]研究發現，青蒿琥酯治療使STZ誘導的大鼠組MMP-9 mRNA表達水平明顯降低，TIMP-1 mRNA 表達水平顯著升高。對天然化合物的深入研究，有助于DR的治療。

3.5靶向微小RNA (microRNA, miRNA)治療 多年來，基因治療DR對研究者們一直有很大的誘惑力。隨著對DR潛在的遺傳機制和表觀遺傳修飾認識的不斷提高，這種治療DR的方法不斷地被研究。miRNA是一種短鏈非編碼RNA，與基因表達的轉錄后調控有關，與一些DR新的治療方法有關[39]。值得注意的是，血清miRNA-126和miRNA-132的水平可作為PDR的早期標志物[40]。有研究指出miRNA-365通過抑制TIMP-3在DR發病機制中發揮重要作用[41]。Yang等[42]研究發現，miRNA-15b可能通過靶向3'-UTR區域抑制VEGF基因轉錄來調控其表達，進而抑制PDR的發展。有研究證實，在高糖誘導的視網膜色素上皮細胞(retinal pigment epithelial cells，RPEs)中，miR-200a-3p的過表達抑制細胞凋亡、MMP-2/MMP-9活性和VEGF表達，可阻止DR的發展[43]。盡管大量基于miRNA的化合物已經被研究，但其中只有少數進入了臨床開發階段。由于miRNA與幾乎所有的生理、病理過程密切相關，因此基于miRNA的構建物具有巨大的治療潛力。

3.6MMPs基因表達的靶向表觀遺傳調控 Kowluru等[44]研究發現，編碼MMP-9和線粒體超氧化物歧化酶的基因可以在糖尿病環境中進行表觀遺傳修飾。接下來的研究發現，DNA甲基化在糖尿病視網膜MMP-9的轉錄調控中起著關鍵作用[45]。糖尿病患者氧化應激損傷增加，調節DNA甲基化，調節氧化應激抑制MMP-9的激活，可避免DR進一步惡化[46]。2020年又有了新的突破，研究發現，同型半胱氨酸通過減少TIMP-1與MMP-9的相互作用，減少MMP-9激活，調節DNA甲基化，減緩DR的進展[47]。深入了解氧化應激損傷的過程，有助于治療DR。

4 小結與展望

由于人類壽命的延長和糖尿病患病率的增加，DR使醫學界面臨巨大的挑戰。氧化應激損傷、炎癥、遺傳因素、晚期糖基化終產物形成增加、多元醇途徑的激活和蛋白激酶C可能在DR的發病機制中發揮著重要作用，以MMPs為治療靶點是目前研究的熱點。MMPs調節多個信號通路，參與DR的發病。目前治療DR的方法很多，但存在一定的局限性。TIMPs可作為DR的潛在治療方法，但需要對TIMP/MMP靶向系統有更詳細的了解，尤其是在生物學和疾病過程中的相互作用。然而，TIMP和MMPs的平衡關系及具體機制有待進一步研究，以更好地應用于DR治療。