miR-326的功能及其在自身免疫病中作用的研究進展①

徐 璐 王麗華 盧曉宇 王健健 張薈雪 （哈爾濱醫科大學附屬第二醫院神經內科，哈爾濱 150081）

免疫系統是一種可防止病原體侵害機體的復雜機制，其通過巨噬細胞和樹突狀細胞的吞噬作用清除體內變形、衰老的細胞及免疫復合物等，同時對自身成分保持耐受。然而，當免疫開始向病原性自身免疫發展時，機體的免疫穩態將被打破，最終導致自身免疫病（autoimmune disease，AD）［1］。近年來，國內外研究者發現各類微小RNA（microRNA，miRNA）介導多種AD 甚至腫瘤等病理過程，其中，miR-326 在AD 中的作用已引起廣泛關注。DU 等［2］在對多發性硬化（multiple sclerosis，MS）患者和自身免疫性腦脊髓炎（experimental autoimmune encepha‐lomyelitis，EAE）動物模型的研究中均發現miR-326表達明顯升高；SEBASTIANI 等［3］研究證實1 型糖尿病（type 1 diabetes mellitus，T1DM）患者外周血中miR-326 表達顯著增高；此外，SUN 等［4］在系統性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）、ZHAO等［5］和LIU 等［6］在自身免疫性甲狀腺炎（autoimmune thyroiditis，AIT）中也報道了類似的發現。而LIU等［7］在針對免疫性血小板減少癥（immune thrombocyto‐penia，ITP）患者的研究中則發現miR-326 表達明顯下調，以上研究均表明miR-326在AD中發揮至關重要的作用。本文從miR-326 的功能及作用機制入手，對miR-326 在AD 中的研究進展進行綜述，旨在為AD的研究提供新思路。

1 miRNA的表達與功能

全基因組轉錄組譜分析揭示了人類基因組中存在miRNA，miRNA 是一類由18~25 個核苷酸組成的單鏈小分子非編碼RNA，其廣泛存在于基因調控、表觀遺傳基因調控和蛋白質功能調控的各個階段［8］。據估計，人類基因組中大約有1 500個miRNAs，這些miRNAs 潛在調節20%~30%的人類基因［9］。miRNA 的生物發生包括一系列成熟步驟：miRNA 首先通過RNA 聚合酶Ⅱ在細胞核中轉錄為初級mi-RNA（pri-miRNA），pri-miRNA 被酶-蛋白質微處理器復合物識別并切割為70~100 個核苷酸長的前體miRNA（pre-miRNA），這些pre-miRNA 被轉運至細胞質后，Dicer（RNA 聚合酶Ⅲ家族成員）與其5'及3'末端相互作用，進一步切割以產生20個核苷酸長的miRNA/miRNA 雙鏈體，此雙鏈體被Argonaute 蛋白（AGO）整合到RNA 誘導的沉默復合體（RNA-in‐duced silencing complex，RISC）上，后者提供了引導miRNA 鏈錨定至靶標mRNA 的作用，在此過程中，與引導鏈互補的miRNA 鏈降解并允許引導鏈mi-RNA 與靶mRNA 的3'端非編碼區（untranslated re‐gions，UTR）相互作用以調節其表達［10］。一旦引導鏈miRNA 和靶基因mRNA 間的互補堿基匹配并穩定，RISC 復合體的AGO 蛋白就會誘導靶mRNA 的內切核酸裂解，從而導致mRNA 降解，發揮負性調控基因表達作用［11］。miRNA 不僅可與靶基因mRNA 的3'UTR 互補結合導致mRNA 降解或翻譯沉默，也可與靶基因的5'UTR、啟動子或編碼區結合［12］。

隨著基因組學技術，特別是高通量基因測序的發展，miRNA 的作用已出現在各種生物學過程中，如細胞分化、凋亡、染色質重塑、轉錄后翻譯修飾、蛋白質轉運等。此外，miRNA 在大多數基因調控途徑的轉錄后水平中發揮關鍵作用，調節先天和適應性免疫應答，通過改變免疫應答在AD 甚至腫瘤的發病中發揮重要作用［13］。

2 miRNA在AD中的作用及研究現狀

miRNA 在先天免疫的不同方面發揮重要作用，如控制并殺死微生物、介導細胞因子的產生等。此外，miRNA 也被確認在不同類型的效應性T 輔助細胞亞群，如T 輔助細胞（Th1、Th2、Th17、Th9）、濾泡性T 輔助細胞和調節性T 細胞（Treg）中發揮至關重要的作用。這些效應性T輔助細胞在炎癥反應中可誘導和抑制miRNA 表達進而產生促炎或抗炎作用，因此，它們是炎癥的關鍵調控因子［14］。一些細胞因子，如IFN-γ 和IL-17 在T 細胞中產生，負責Th1 和Th17 的分化，已被證明參與AD 的病理過程［15］。miRNA 是正常免疫T 細胞功能所必需的，一些特定的miRNAs與T細胞的功能或發育直接或間接相關，包括CD8+T 細胞（miR-150、miR-21 和miR-155）、Th2（miR-150 或miR-146a）、Th1（miR-147 或miR-155）和Th17等［16］。

在免疫細胞發育過程中，miRNA 調控紊亂可能導致AD 發生。例如，miR-155 在MS 中高表達［17］；miR-146a 在T1DM 及SLE 中均顯著下調［18］；miR-21在MS 患者外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）中表達增加，與此同時還發現miR-21 缺陷型小鼠對EAE 的發生具有抵抗性［19-20］。另外，在牛皮癬及炎癥性腸病患者中也發現miR-21 表達增加［21］。除以上幾種miRNAs 外，還有其他miRNAs 通過調節T 淋巴細胞分化在自身免疫中發揮重要作用，如miR-27a 可抑制Th17 分化，因而在MS 中被下調［22］。還有研究者提出，miR-140-5p 通過抑制轉錄因子STAT1 的激活來抑制Th1分化，從而提供了針對MS 發生的保護作用［23］。然而，大多數miRNAs 在體內的功能是未知的，研究miRNA 在AD 中的作用不僅有助于了解這些疾病的發病機制，而且有助于探尋預防和治療這類嚴重疾病的方法。

3 miR-326的概述

miR-326是含有20個由11號染色體內含子1編碼的核苷酸，最初被鑒定為神經元中的一種神經特異性miRNA，在轉錄后水平調控宿主基因組表達方面發揮關鍵作用，并發現其表達可能與抑制素基因（β基因）表達呈正相關［24］。近年來，miR-326得到了廣泛研究，其在免疫穩態的成熟、分化和維持等過程中發揮重要作用［25-26］。生物信息學研究顯示miR-326 的靶基因有整合素金屬蛋白酶17（ADAM17）、CD47、Ets-1、GLI1、IL-17、丙酮酸激酶M2（PKM2）、PTEN、維生素D3 受體（VDR）等［27］。在miR-326 介導的AD 中，VDR、CD47、Ets-1 是研究最為廣泛的3 種靶基因。其中，VDR 參與調節免疫細胞穩態的維持，miR-326 基因過表達可抑制免疫細胞中VDR的表達進而誘發某些AD 發生［3］；CD47 作為一種跨膜蛋白，在控制和遷移巨噬細胞吞噬中起主要作用，這種作用在一些AD中能夠促進Th17的分化［28］；Ets-1 是一種可直接調節細胞因子和趨化因子基因表達的轉錄因子，主要功能是調節淋巴樣細胞分化和增殖。Ets-1 參與調節體內免疫細胞的平衡，是Th17 分化的反向調節因子，其通過自身表現的“抗miR-326”屬性而被視為miR-326的功能靶標［29］。此外，KEFAS 等［30-31］發現miR-326 通過靶向調控Notch1/2 及PKM2 從而削弱多種細胞的增殖和侵襲。而M?LLER 等［32］認為miR-326 與Notch 是以負反饋的方式相互調節，即miR-326 直接調節Notch-1的表達，而其本身又可受到反饋環路的調節。miR-326 下調可能改變細胞的生長、侵襲和代謝活性這一理論還需深入研究。此外，Wnt 信號通路也被認為與AD 密切相關［33］，然而，miR-326 與Wnt 信號通路在介導AD 的發病中是否存在聯系，仍有待進一步證明。

4 miR-326在AD中的研究

4.1 miR-326與MS MS是一種慢性炎癥性脫髓鞘中樞神經系統疾病，其機制是由于人體免疫系統異常攻擊神經髓鞘，引起炎癥及相關損傷，進而破壞大腦、視神經和脊髓的正常功能，最終導致神經系統功能惡化［34］。DU 等［2］研究發現，miR-326 的表達與MS 患者和EAE 小鼠的疾病嚴重程度高度相關，在體內沉默miR-326 可導致Th17 減少和EAE 減輕，而其過表達可導致Th17細胞增殖和EAE癥狀加重，這可能是由于miR-326 通過靶向調控Th17 細胞分化的負性調控因子Ets-1，從而促進了Th17 細胞分化。miRNA 表達譜分析顯示，在MS 患者的PBMC、全血、血清中miR-326 水平均可能發生改變［35］。然而，MATHEW 等［36］分析了59例MS患者和37例健康對照者外周血樣本中27 種miRNAs 的表達，結果顯示miR-326 的表達在MS 病例組及健康對照組中無明顯差別。此外，MOHAMMAD 等［37］認為miR-326可用于區分MS的復發期和緩解期，且miR-326可通過影響TGF-β 信號傳導途徑促進Th17 細胞分化。綜上，miR-326 的表達水平可能預測MS 的發病，其靶基因Ets-1在其中發揮重要作用，但其分子機制及其與其他炎癥相關通路的關系仍未完全闡明，且miR-326 的其他靶基因是否也參與MS 的發病有待深入研究。

4.2 miR-326 與T1DM T1DM 是一種多基因參與的AD，其特征是自身免疫反應攻擊胰島β細胞進而導致胰島素分泌不足。VDR 由大量免疫細胞，如活化的T 細胞產生，VDR 多態性導致的VDR 功能改變已被引入包括T1DM 等AD 的發病機制中［38］。SEBASTIANI 等［3］在一項針對19 例T1DM 患者的研究中發現，miR-326 過表達可能會導致免疫細胞中VDR 下調；ZIPITIS 等［39］研究發現與未補充維生素D（VD）的嬰兒相比，補充VD 的嬰兒長大后罹患T1DM 的風險降低29%，且在T1DM 動物模型中使用高劑量VD 或VD 類似物時，可預防糖尿病或抑制其進展。此外，有研究報道抑制肌營養蛋白基因（Mtpn）會導致胰島素分泌減少，AZHIR 等［40］研究表明，miR-326過表達可能導致Mtpn表達下調。同時，miR-326過表達可能通過促進Th17細胞分化進而參與T1DM 的致病性。因此，進一步探索miR-326 與VDR、Mtpn 對Th17 細胞的影響，有望闡明T1DM 的發病機制，并為靶向治療甚至預防T1DM 提供有效策略。

4.3 miR-326 與SLE SLE 是一種慢性、多系統性、復雜的AD，可影響多個組織和器官，且具有不同的臨床表現［41］。盡管尚未闡明SLE 的確切病因，但遺傳、環境、內分泌和其他因素可能在SLE的發生發展中發揮重要作用［42］。T 淋巴細胞不僅可通過直接接觸影響其他免疫細胞，還可通過分泌促炎癥細胞因子并直接作用于靶組織來參與SLE 發展，但其與miR-326的關系有待證明［43］。此外，B淋巴細胞被認為是SLE 發病的主要參與者，XIA 等［44］認為MRL/lpr小鼠中的miR-326 過表達可導致B 淋巴細胞過度活化和嚴重的SLE。進一步研究發現，SLE中B淋巴細胞內升高的miR-326 通過下調Ets-1 促進漿細胞發育和抗體產生。CHEN 等［45］在一項針對8 例SLE 患者的研究中發現其miR-155、miR-223、miR-224、miR-326 及miR-342 表達均升高。此外，SUN 等［4］通過一項針對53例SLE 患者的研究中描述了miR-326過表達可導致Ets-1 mRNA 水平降低。綜上，miR-326 的表達水平可能與SLE 癥狀呈正相關，理論上，通過靶向抑制miR-326 的表達進而有效抑制SLE 患者體內自身免疫反應的產生，有望使SLE 取得滿意療效。然而，這有待通過完善SLE 動物模型及設計體內實驗來進一步證實。

4.4 miR-326 與AIT AIT 是最常見的AD 之一，橋本甲狀腺炎（Hashimoto thyroiditis，HT）是一種主要的AIT，HT 的病理特征是淋巴細胞浸潤和甲狀腺濾泡組織病變，HT患者的血清循環甲狀腺抗體主要是抗甲狀腺過氧化物酶抗體（TPOAbs）和甲狀腺球蛋白抗體（TgAbs），可導致甲狀腺纖維化或萎縮并伴有甲狀腺功能減退［46］。ZHAO 等［5］通過建立碘誘導的AIT小鼠模型證明miR-326高表達可使Th17顯著增加，且miR-326抑制Ets-1蛋白表達能夠促進Th17細胞分化，最終促進碘化物誘發AIT。LIU 等［6］研究發現，HT 患者miR-326 表達水平升高，隨著PBMC中miR-326的過表達，Th17細胞的分化得以增強，與此同時，HT 患者的ADAM17 表達降低，基于以上發現，miR-326 可能通過靶向抑制ADAM17 參與HT 發病。提示深入研究miR-326 介導ADAM17 與Ets-1的表達關系是靶向治療HT 的新思路。值得注意的是，研究者發現AIT 患者還經常患有其他AD，如T1DM、SLE、慢性自身免疫性胃炎等［47］，提示miR-326 介導AD 發病可能存在共同通路，且其他AD 的發病機制研究有望為AIT的研究提供新依據。

4.5 miR-326 與ITP ITP 是一種自身免疫介導的血小板破壞和血小板生成受損的AD。目前，miR-326參與ITP的發病機制還處于初步探索階段，其表達水平可能與ITP 嚴重程度呈負相關。LIU 等［7］在46 例ITP 患者和39 例健康對照者的Th 細胞亞群中的研究顯示，ITP 患者中miR-146a、miR-326 和miR-142-3p 表達減少。值得注意的是，miR-326 被證實可通過在體外儲存單采血小板的方式調節抗凋亡基因（Bcl-xL）在血小板中的表達［48］。表明Bcl-xL 也可能是miR-326 的靶基因，且過表達miR-326 有望治療ITP，二者在ITP 中的作用值得深入研究。同時，上調miR-326 在其他AD 中的副作用也不容忽視。此外，萬紅等［49］研究證實，漢族人群PTPN22、TNF-α 基因多態性均可影響ITP 的發生風險，其中PTPN22 的1 123 位點G 突變、TNF-α 863 位點A 突變等均是ITP的危險因素，這些突變是否與miR-326的異常表達相關有待繼續深入研究。

5 miR-326與腫瘤等其他疾病

研究證實miR-326通過抑制細胞增殖、遷移、侵襲并誘導細胞凋亡從而發揮抑癌作用。miR-326 作為腫瘤抑制因子參與了如非小細胞肺癌、食管鱗狀細胞癌、膠質母細胞瘤等的形成和進展［50-52］。例如miR-326 還可顯著抑制非小細胞肺癌細胞的增殖和侵襲［50］；miR-326 可靶向抑制MAPK/MEK 信號通路的激活，從而影響食管鱗狀癌細胞的增殖、遷移、侵襲和凋亡［51］；且miR-326 在膠質母細胞瘤組織中表達水平降低，并可能調節神經膠質瘤和神經膠質瘤干細胞的代謝活性［52］。提示miR-326有望成為多種腫瘤的潛在生物標志物和治療靶點，但如何平衡miR-326 在抗腫瘤細胞增殖的同時可能誘導AD 的產生，無疑是未來研究的難點與突破點。此外，miR-326 在膿毒血癥患者中也存在異常表達［53］，這些都為深入研究miR-326 在AD 中的作用提供了更多方向。

6 展望

綜上所述，miR-326 與AD 的發生發展關系密切，但其表達水平和介導的靶基因在不同AD 中各有差異，深入研究miR-326與其各類靶基因在AD中的作用，有望為AD 的靶向治療提供新依據，然而，目前miR-326在AD中的研究還處于初步探索階段，仍有待通過完善AD 動物模型和體內實驗方案進一步闡明。此外，值得注意的是，因為miR-326的腫瘤抑制作用，下調其表達可能導致腫瘤細胞增殖。因此，探究miR-326在介導AD中的敏感靶基因及信號轉導通路是未來重要的研究方向。