基于耳石微化學特征甄別黑鯛放流群體和野生群體的初步研究

張 翼，張 輝，姜亞洲，凌建忠，劉尊雷，李圣法

(中國水產科學研究院東海水產研究所，農業農村部東海漁業資源開發利用重點實驗室，上海 200090)

增殖放流苗種標記是研究放流對象生長、洄游、增殖放流功效評估的重要手段[1]。國內外常見的標記方法包括掛牌標志、剪鰭法、微衛星標記、耳石元素標記等[2-4]。有效區分野生魚種和養殖魚種是增殖放流評估的重要內容，魚類耳石常被用于該項研究工作。耳石是一種典型的生命礦物載體，主要由碳酸鈣及一些微量元素組成，且具有特定的耳石微結構[5]。有學者基于耳石微結構的研究方法對野生魚種和養殖魚種進行了區分[6-7]。隨著技術的進步，耳石微化學方法也常被用于鑒別野生魚種和養殖魚種[8-9]。在苗種的培育過程中，水溫、鹽度、餌料等外部條件可能會在魚類耳石上形成特殊印記，這種印記可用于識別養殖魚種和野生魚種。例如，宋昭彬和曹文宣[10]利用水溫可能導致的草魚(Ctenopharyngodonidellus)與鰱(Hypophthalmichthysmolitrix)仔魚耳石中心核的大小差異特征，有效區分了野生群體和養殖群體；受餌料來源和魚體生長率差異的影響，13C成為識別野生西大西洋笛鯛(Lutjanuscampechanus)和養殖西大西洋笛鯛的關鍵元素[11]。在育苗過程中，所采取的日常管理措施可能在魚類耳石上產生特殊的“印跡”，從而形成耳石標志。

黑鯛(Sparusmacrocephalus)是一種廣泛分布于我國沿海的島礁性魚類，也是一種重要的增殖放流對象。對于黑鯛這種放流規模大、范圍廣、周期長的魚種，常規的標記方法往往費時費力。研建一種適合黑鯛的、易推廣、低成本的標記方法成為有效推進黑鯛增殖放流評估工作的關鍵。黑鯛耳石元素標記成功的3個可行性條件：1)魚耳石中鍶Sr和鋇Ba元素主要來源于魚類生活的水體[17]；2)淡水Ba濃度一般高于海水[13-14]，海水Sr濃度顯著高于淡水[15-16]；3)黑鯛育苗的適宜鹽度為18～25[12]。我國近岸海水鹽度約為30～33。據此，在黑鯛的育苗過程中，向天然海水種添加淡水降低鹽度后，形成養殖海水，這種養殖海水的Sr、Ba元素可能與天然海水有顯著差異，從而可能在耳石上形成特殊的微化學標志。

本研究以黑鯛為研究對象，通過開展基于耳石微化學分析的實驗，分析養殖黑鯛幼魚與野生黑鯛幼魚的耳石微化學特征，探究了基于日常管理措施的養殖黑鯛耳石元素標記方法的可行性，同時對黑鯛成魚進行耳石元素標志識別的驗證，以期為利用該項技術開展黑鯛增殖放流標記提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料采集及樣品處理

2019年5—6月，在象山港開展黑鯛增殖放流活動前，利用流刺網采集黑鯛幼魚樣品，并記錄采樣站位的水溫、鹽度。采集到的黑鯛體長3.05～3.89 cm，樣本量20尾。根據采樣時間和體長判定所采集到的這些樣品為野生黑鯛幼魚。同年6月，在寧波市象山港水產引種育種有限公司采集養殖黑鯛幼魚，體長1.96～3.61 cm，樣本量30尾。在黑鯛的育苗過程中，每天向天然海水中添加淡水(自來水)來調節養殖海水鹽度，將養殖海水的鹽度保持在育苗的適宜鹽度18～25[12]，持續時間至少30 d。記錄象山港天然海水和養殖海水的鹽度。隨機采集5 d的天然海水、淡水和養殖海水的樣品，經微孔濾膜(孔徑0.45 μm)過濾去除雜質后，用塑料瓶收集保存，帶回實驗室檢測Sr、Ba元素濃度。2020年8月，在象山港采集黑鯛成魚樣品，體長10.6～19.5 cm，樣本量為20尾。

黑鯛樣品經冰鮮冷藏帶回實驗室分析。去除耳石表面的雜質，用超純水清洗3 min。將清洗好的耳石放入準備好的塑料模具中，使用環氧樹脂包埋，室溫下放置24 h待其凝固、硬化。耳石固定后，用600目砂紙在研磨機上研磨，再使用1 000目、1 500目砂紙手工打磨，最后用3 μm 的碳化硅拋光紙拋光，直至在光學顯微鏡下觀察到耳石原基出現，制成厚度約為0.5 mm的薄片。

1.2 耳石元素分析

采用激光燒蝕聯動的電感耦合等離子質譜儀(LA-ICP-MS)對耳石樣本進行元素分析。利用NewWave213激光剝蝕系統對耳石樣品進行線掃描和打點剝蝕后，經氦氣作載氣、氬氣作輔助氣，通過Thermo X Series II ICP-MS進行微量元素測定。激光剝蝕的波長為213 nm，剝蝕孔徑為32 μm，剝蝕深度為20 μm，激光移動速度為2μm·s-1。在無任何樣品的條件下，對氬氣和氦氣混合氣體進行LA-ICP-MS 測試, 重復10次，3倍空白標準偏差所對應的濃度即為各元素的檢出限。數據分析時采用氦氣和氬氣的混合氣體作為空白對照，采用碳酸鹽標準物MACS-3對耳石元素含量進行定量分析。

耳石元素分析方法包括耳石核心處元素分析和從核心向邊緣線掃描元素分析(圖1)。分析的指示微量元素有Sr、Ba兩種。耳石核心處元素檢測的位置設定為耳石原基處附近，檢測方法為多點剝蝕，剝蝕的時間設置為60 s。線掃描分析的方法為從耳石核心沿著最長軸向邊緣直線剝蝕檢測。經濾膜過濾的天然海水、養殖海水、淡水交由北京科薈測試技術有限公司檢測。

圖1 黑鯛耳石核心打點樣及線掃描示意圖

1.3 數據分析

實驗完成后將數據導入到ICP-MS DataCal軟件中，數據分析時, 先根據各元素的最低檢測限(lowest detection limit)等指標評價元素測定值的有效性, 去除無效元素, 只對在所有耳石個體中均被檢測出的有效元素做數據分析。計算耳石樣本從核心至耳石邊緣的Sr/Ca、Ba/Ca比值(摩爾比)；

依據上述檢測數據計算：

1)計算耳石核心Sr/Ca、Ba/Ca比值(C)；

3)引入變異系數[18](CVI)評價耳石核心至邊緣的微量元素的波動變化特征。

2 結果與分析

2.1 黑鯛養殖水體鍶鋇元素分析

2019年5—6月，象山港天然海水鹽度為25～27，表層水溫18～22℃。黑鯛育苗適宜的鹽度為23～24，注入淡水后，養殖海水鹽度低于天然海水約2。象山港天然海水和養殖海水Sr離子濃度分別為(5 428.67±72.93)、(4 377.59±52.85)μg·L-1；Ba離子濃度(27.33±1.39)、(41.97±1.62)μg·L-1；Ca離子濃度(342.60±2.57)、(289.20±2.78)mg·L-1(表1)。天然海水和養殖海水的Sr/Ca比值分別為(7.20±0.09)、(6.96±0.08)mmol·mol-1，Ba/Ca比值分別為(23.3±1.2)、(42.3±1.6)μmol·mol-1。養殖海水的Sr/Ca比值、Ba/Ca比值約為天然海水的0.96、1.82倍。養殖海水Ba離子濃度顯著高于天然海水(P<0.05)。

表1 天然海水、養殖海水和淡水鍶鋇元素分析

2.2 黑鯛耳石元素線定量分析

從耳石核心到邊緣方向對養殖黑鯛和野生黑鯛耳石的Sr/Ca、Ba/Ca比值進行測定，如圖2所示，養殖黑鯛和野生黑鯛耳石中Sr/Ca比值為1.5～2.0 mmol·mol-1，且Sr/Ca比值波動較小。養殖黑鯛耳石Ba/Ca比值為10～25 μmol·mol-1，野生黑鯛耳石Ba/Ca比值為3～8 μmol·mol-1；養殖黑鯛耳石中的Ba/Ca比波動明顯，野生黑鯛耳石Ba/Ca比波動相對較小。分析結果表明，養殖黑鯛和野生黑鯛耳石Sr/Ca比值無明顯差異，但養殖黑鯛耳石中的Ba/Ca比值明顯高于野生黑鯛。養殖黑鯛耳石半徑長約為400 μm。

圖2 養殖與野生黑鯛耳石的Sr/Ca、Ba/Ca比

2.3 耳石微量元素特征分析

表2 養殖黑鯛和野生黑鯛耳石核心、全耳石的Sr/Ca、Ba/Ca比值及其變異系數分析

養殖黑鯛和野生黑鯛耳石Sr/Ca比值變異系數(CVISr/Ca)分別為0.14±0.01、0.13±0.01，兩者無顯著差異(P>0.05)；養殖黑鯛和野生黑鯛耳石Ba/Ca比值元素變異系數(CVIBa/Ca)分別為1.26±0.3、0.69±0.15，養殖黑鯛Ba/Ca比值變異系數(CVIBa/Ca)明顯高于野生黑鯛(P<0.05)。

2.4 基于耳石Ba元素的象山港放流黑鯛判定

圖3 養殖與野生黑鯛耳石核心至邊緣Ba/Ca比值

3 討論

3.1 放流黑鯛耳石Ba元素識別的可行性分析

水環境因子可能對魚類耳石上Ba的沉積有影響。有研究表明，溫度對大底鳉(Fundulusgrandis)、金赤鯛(Pagrusauratus)的耳石Ba的富集無顯著影響[22-23]；鹽度對耳石Ba的富集影響研究有不同的結論[24-26]。本研究中,通過向天然海水中添加淡水來降低養殖海水的鹽度，但鹽度變化僅為3～4，根據黎雨軒等[27]、VRIES等[28]的研究可以推測，在輕微的鹽度變化下，耳石上Ba的富集效應變化不大。此外，魚體個體發育的生理作用也可能會影響耳石上Ba的富集，但由于本研究所分析的兩個黑鯛群體的耳石位置是相同的，同為0～400 μm區段，即兩個黑鯛群體所對應的發育階段也是相同的，因此，個體發育的生理作用對兩個黑鯛群體耳石上所產生的Ba/Ca比值差異沒有直接影響。綜上，本研究中溫度、鹽度和生理作用對耳石Ba/Ca比值的影響應該是次要的，形成養殖黑鯛耳石高Ba/Ca比值標志的主要原因是養殖海水的高Ba離子濃度。

本研究中，養殖海水的Ba濃度約為天然海水的1.82倍，而養殖黑鯛耳石的Ba/Ca比值約為野生群體的4倍，可推測養殖黑鯛耳石上Ba的沉積存在富集作用。發生Ba富集的可能原因有：1)鹽度與耳石上的Ba富集能力可能呈負相關關系[29]；2)水溫與耳石上的Ba富集能力可能呈正相關關系[30]。為了深入研究耳石上Ba的沉積作用，需要對海水中Ba濃度與耳石Ba/Ca比值的定量分析做進一步研究。

3.2 放流黑鯛耳石Sr元素識別的可行性分析

3.3 利用耳石Ba/Ca比值標志識別放流黑鯛

對象山港捕撈到的黑鯛樣品進行Ba/Ca比值時間序列分析，依照上述的判別方法成功識別了放流黑鯛。這兩尾放流黑鯛，其耳石在0～400 μm位置內，Ba/Ca比值顯著高于野生黑鯛，而在400 μm往后的位置，其Ba/Ca比值與野生黑鯛重疊(圖3)。400 μm耳石徑長所對應的黑鯛體長與規模化放流黑鯛的體長吻合，這一點也進一步證明了耳石上高Ba/Ca比值能夠成為放流黑鯛判別標志的可行性。多個研究結果同樣表明，養殖魚種和野生魚種耳石上的Ba/Ca比值存在顯著差異[33-34]。耳石激光剝蝕元素指紋分析在魚類來源識別的研究中具有樣品制備簡單、可多元素分析等優勢[35]。本研究僅對Sr、Ba元素進行了分析，有學者利用多元素線性判別分析方法對虹鱒(Oncorhynchusmykiss)[33]等魚類進行分析，也能有效識別野生群體和養殖群體。此外，13C、18O同位素可提高耳石元素識別分析的準確率[35-36]。為了進一步提高放流黑鯛的識別可靠性，以后可引入更多的元素進行輔助分析。