硬毛常山中EHP對人結直腸癌細胞HCT-15增殖和凋亡的影響

呂 典，冷露芬，張 琪，王阿英，賴 祺，易春蝶，馬燕華，尹俊林，曾廣智

(云南民族大學 民族醫藥學院，民族藥資源化學國家民委-教育部重點實驗室,云南 昆明 650500)

結腸癌(colorectal canser，CRC)是全球第3大常見癌癥，其死亡率居全球第2[1].目前有效的診斷方式和治療措施使結直腸癌的發病率和死亡率得到了下降[2-3]，但術后5年生存率仍小于50%[4]，且患者發病率呈年輕化趨勢[1]，嚴重威脅到人們的生命健康.所以探索結腸癌治療方法和開發結直腸藥物仍具有重要意義.

常山屬(DichroaLour.)植物屬于虎耳草科的小屬，共有12種，分布從亞洲南部大陸到太平洋島嶼，其中有6種存在我國華南和印度[5].常山屬植物主要含有生物堿[6]、香豆素[6]、多酚[7]和甾體[8]等成分，具有抗瘧疾[9]、抗病毒[10]和抗腫瘤[11]等生物活性.目前對于硬毛常山(DichroahirsutaGagnep.)的研究相對較少，本研究從硬毛常山中分離得到的化合物(E)-6-(4-羥基苯基)-庚-3-烯-2-酮(EHP)化學結構圖見圖1.發現其對人結直腸癌細胞HCT-15具有較好的增殖抑制活性，探討了其對人結直腸癌HCT-15的增殖抑制作用和機理，發現EHP主要通過細胞周期阻滯，誘導HCT-15細胞的凋亡，抑制了人結直腸癌HCT-15細胞增殖.

圖1 EHP化學結構圖

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

人宮頸癌細胞Hela、人結直腸癌細胞HCT-15、人乳腺癌細胞MDA-MB-231(中科院昆明植物所)；RPMI 1640、DMEM、胰酶、PBS(BBI，中國)；0.4%結晶紫(索萊寶，中國)；臺盼藍試劑盒(碧云天，中國)；RIPA裂解液、凋亡試劑盒、周期試劑盒(翊圣，中國)；CDK1、CDK2、CDK4、Cyclin A2、Cyclin B1、Cyclin D1、Cyclin E1、P53、P27、P21、PARP 1、cleaved PARP 1、Caspase 9、active Caspase 9、Caspase 3、active Caspase 3、GADPH和β-actin(Proteintech，中國).3425型二氧化碳細胞培養箱(Thermo Scientific，美國)；垂直電泳儀(Bio-rad，美國)；TS-2000A搖床(Kulin-bell，中國)；SpectraMax i3x型微孔板檢測器(Molecular Devices，美國)；DMIL LED型倒置顯微鏡和DMI8型熒光倒置顯微鏡(徠卡，德國).

1.2 細胞培養

Hela和MDA-MB-231用含有10%FBS的DMEM培養基，HCT-15用含有10%FBS的RPMI 1640培養基，于 37 ℃、含5%CO2的細胞培養箱中培養.根據不同細胞生長情況、傳代數量及細胞狀態約 3 d 傳代一次，以維持細胞良好生長狀態.

1.3 SRB檢測細胞增殖

取對數生長期的Hela、HCT-15和MDA-MB-231細胞以5×103個/孔，鋪于96孔板，37 ℃、含5%CO2的細胞培養箱培養 24 h.按照4、20、100 μmol/L 濃度配制EHP，加入96孔板中，每個濃度設置3個復孔，同時設置空白和DMSO溶劑對照，繼續培養 48 h.加入50%TCA固定細胞1h，洗板，晾干，4%SRB染色 0.5 h，洗板，晾干，加入 4 mmol/L Tris溶液，搖床 5 min，515 nm 多功能酶標儀檢測吸光度，根據結果計算細胞活力.

1.4 臺盼藍染色

取對數生長期的HCT-15細胞以1.2×105個/孔鋪于12孔板，37 ℃、含5%CO2的細胞培養箱培養 24 h.按照10、20、50 μmol/L 濃度配制EHP，加入12孔板，同時設置空白對照，繼續培養 24 h.收集細胞，臺盼藍以濃度0.4%重懸細胞，染色 3 min，血細胞計數板計數或拍照，計算細胞存活率.

1.5 平板克隆

取對數生長期的HCT-15細胞以200個/孔，鋪于12孔板，37 ℃、含5%CO2的細胞培養箱培養約 3 d，直至形成肉眼可見細胞團.按照10、20、50 μmol/L 濃度配制EHP，加入12孔板，同時設置空白對照，繼續培養 10 d.收板，加無水乙醇固定 15 min，0.4%結晶紫染色 5 min，顯微鏡下觀察，并用相機拍照.

1.6 細胞周期和Western blot實驗

取對數生長期的HCT-15細胞以1.2×105個/孔，鋪于12孔板，37 ℃、含5%CO2的細胞培養箱培養 24 h.按照10、20、50 μmol/L 濃度配制EHP，加入12孔板，同時設置空白對照，繼續培養 24 h.收細胞，70%乙醇固定細胞過夜，PI染色，37 ℃ 孵育 30 min，流式細胞儀檢測.

收集HCT-15細胞，RIPA裂解液冰上裂解細胞，按比例加入5×loading buffer.將各蛋白上樣于10%SDS-PAGE中進行電泳，PVDF膜濕法轉印.5%脫脂奶粉室溫封閉 2 h.2%脫脂奶粉稀釋一抗CDK1(1∶3 000)、CDK2(1∶4 000)、CDK4(1∶3 000)、Cyclin A2(1∶4 500)、Cyclin B1(1∶3 500)、Cyclin D1(1∶3 000)、Cyclin E1(1∶3 000)、P53(1∶3 000)、P27(1∶3 000)、P21(1∶3 000)、GADPH(1∶15 000)和β-actin(1∶15 000)于 4 ℃ 過夜孵育，TBST洗膜，2%脫脂奶粉稀釋二抗(1∶7 000)室溫下孵育 2 h，TBST洗膜.最后，ECL化學發光反應液顯影，于化學發光顯影儀檢測蛋白條帶，同時進行半定量灰度分析.

1.7 凋亡和Western blot實驗

取對數生長期的HCT-15細胞以1.2×105個/孔，鋪于12孔板，37 ℃、含5%CO2的細胞培養箱培養 24 h.按照 100 μmol/L 終濃度配制EHP，40 μmol/L 終濃度配制凋亡抑制劑Z-VAD-FAM，5 μmol/L 終濃度配制喜樹堿(CPT)，各組分別以 100 μL EHP、50 μL EHP+50 μL Z-VAD-FAM、100 μL CPT體積加入12孔板，同時設置空白對照，繼續培養 24 h.收細胞，V-FITC和PI染色，室溫、避光孵育 15 min，流式細胞儀檢測.

收集HCT-15細胞，RIPA裂解液冰上裂解細胞，按比例加入5×loading buffer.將各蛋白上樣于10%SDS-PAGE中進行電泳，PVDF膜濕法轉印.5%脫脂奶粉室溫封閉 2 h.2%脫脂奶粉稀釋一抗PARP 1(1∶4 000)、cleaved PARP 1(1∶3 000)、Caspase 9(1∶3 500)、active Caspase 9(1∶3 000)、Caspase 3(1∶3 000)、active Caspase 3(1∶2 500)、GADPH(1∶15 000)和β-actin(1∶15 000)于 4 ℃ 過夜孵育，TBST洗膜.2%脫脂奶粉稀釋二抗(1∶7 000)室溫下孵育 2 h，TBST洗膜.最后，ECL化學發光反應液顯影，于化學發光顯影儀檢測蛋白條帶，同時進行半定量灰度分析.

1.8 統計學分析

統計學分析使用GraphPad Prism 8軟件進行，3次獨立重復實驗，以平均值±標準差表示，采用單因素One-way ANOVA檢驗分析2組間顯著性差異，*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001，****表示p<0.000 1.

2 結果

3次獨立重復實驗，以平均值±標準差表示，采用單因素One-way ANOVA檢驗分析2組間顯著性差異，*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001，****表示p<0.0001.

2.1 EHP抑制結直腸癌細胞增殖

SRB實驗檢測EHP對Hela、HCT-15和MDA-MB-231細胞增殖活力，與對照組相比，EHP在20、100 μmol/L 濃度下，顯著抑制細胞增殖，在 4 μmol/L 濃度下沒有明顯的抑制作用(圖2A)，根據不同濃度下細胞抑制率，計算出EHP對Hela、HCT-15和MDA-MB-231細胞作用 48 h 時，IC50分別為21.67±1.49、13.61±0.71、25.67±1.33 μmol/L，可以得出其對人結直腸癌HCT-15抑制效果最明顯.

對不同EHP摩爾濃度下的HCT-15進行臺盼藍染色(圖2B)，隨著EHP摩爾濃度的增加，細胞數量減少，且皺縮.對平板克隆結果進行觀察(圖2C)，發現細胞集落隨著EHP摩爾濃度增加減少，且形成集落中細胞數量也明顯減少.這些結果說明EHP以摩爾濃度依賴性抑制HCT-15細胞的增殖.

圖2 EHP對HCT-15的增殖抑制影響

2.2 EHP誘導HCT-15細胞G2阻滯

流式細胞儀檢測不同濃度EHP作用下，HCT-15周期各個時期變化(圖3A和3B)，3次獨立重復實驗,以平均值±標準差表示,采用單因素One-way ANOVA檢驗分析2組間顯著性差異,*表示p<0.05,**表示p<0.01.與對照組相比，隨著EHP濃度增加G1期減少，S期整體呈下降趨勢，G2明顯增加(表S1)，說明EHP誘導HCT-15阻滯在G2期.此外，EHP促進HCT-15細胞中CDK1、CDK2、Cyclin B1和Cyclin E1蛋白表達，抑制CDK4、Cyclin A2、Cyclin D1蛋白表達(圖3C和D)，進一步說明了EHP抑制HCT-15細胞增殖發生G2期阻滯.

圖3 EHP對HCT-15細胞周期的影響

2.3 EHP誘導HCT-15細胞凋亡

流式細胞儀檢測 100 μmol/L EHP作用下，HCT-15細胞凋亡情況(圖4A和4B)，3次獨立重復實驗,以平均值±標準差表示，采用單因素One-way ANOVA檢驗分析兩組間顯著性差異,*表示p<0.05，**表示p<0.01,***表示p<0.001,****表示p<0.0001.與空白對照組相比，細胞凋亡明顯，這與陽性藥CPT作用結果相同；加入凋亡抑制劑Z-VAD-FAM，EHP作用下的HCT-15凋亡得到緩解，結果說明Z-VAD-FAM凋亡抑制劑發揮了抑制HCT-15的凋亡作用，進一步證明了EHP誘導了HCT-15的凋亡作用.此外，WB檢測結果(圖4C和4D)顯示，EHP抑制PARP1、Caspase 3、Caspase 9蛋白的表達，促進cleaved PARP1、active Caspase 3、active Caspase 9蛋白的表達，且濃度較高時增強和抑制效果均更為顯著，這些實驗說明EHP誘導人結直腸癌HCT-15細胞發生凋亡.

圖4 EHP對HCT-15細胞凋亡的影響

圖5 EHP對HCT-15細胞中P53通路的影響

2.4 EHP抑制p53通路蛋白表達

Western blot檢測發現不同濃度EHP下調細胞周期上游調控因子P53、P27和P21的表達，并且呈現濃度依賴性(見圖5)，3次獨立重復實驗,以平均值±標準差表示,采用單因素One-way ANOVA檢驗分析2組間顯著性差異,*表示p<0.05,**表示p<0.01. 說明EHP可能通過影響P53通路的表達，抑制細胞周期，從而抑制細胞增殖.

3 討論

結直腸癌是我國常發的消化道惡性腫瘤之一，嚴重威脅的人們生命安全.手術和放化療等醫學治療方式的不斷發展，使結直腸癌致死率得到緩解[2-3].然而復發率仍然很高，化療耐藥性是其復發的一個主要原因[12-13].因此尋找結直腸癌治療的其他藥物顯得尤為重要.硬毛常山屬于常山屬，關于其報道相對較少，本課題組前期研究發現硬毛常山中單體化合EHP具有較好的抗腫瘤效果，特別是可以顯著抑制人結直腸癌細胞HCT-15的增殖.本研究發現，EHP能抑制HCT-15細胞中P53通路蛋白表達，促進CDK1、CDK2、Cyclin B1和Cyclin E1蛋白表達，抑制CDK4、Cyclin A2、Cyclin D1蛋白表達，使細胞周期阻滯在G2期，同時誘導其凋亡.

細胞周期調控著細胞的增殖、復制和分裂進程，主要有3個調控點：G1到S期、S到G2期和G2到M期，分別受不同的基因和蛋白調控[14].細胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)通過使周期蛋白磷酸化而形成復合物，其中形成CDK4/6-Cyclin D1復合物在G1期進程中起著至關重要的作用，在G1后期到S期CDK2-Cyclin E1/A2復合物是必須的，而CDK1- Cyclin B1復合物主要在G2期發揮作用.有報道呋喃二烯酮誘導RKO和HT-29細胞G0/G1期阻滯，主要通過降低CDK4、CDK6、Cyclin D1、CDK2和Cyclin E1，伴隨著P21上調實現的[15].在本實驗中，在EHP作用下，HCT-15腫瘤細胞G1期和S期比例下調，同時檢測到CDK2和Cyclin E1蛋白表達增強，而CDK4 和Cyclin D1表達被抑制，并且與CDK2具有結合作用的 Cyclin A2表達也是減弱.在本實驗中，同時發現EHP促進HCT-15細胞中CDK1和Cyclin B1蛋白表達，綜合以上結果表明EHP誘導HCT-15細胞發生G2期阻滯.

P53是重要的抑癌基因，是周期檢測途徑中關鍵性的蛋白[16]，P53的激活可能導致G1或G2期阻滯.研究表明，P53缺乏(突變或缺失)能誘導G2/M期阻滯，并且在P53缺失的細胞中，其作用途徑從P21依賴轉變成Chk依賴[17-19].CDK相互作用蛋白1(P21)和激酶抑制蛋白1(P27)屬于調節細胞周期進程的CIP/KIP蛋白家族[20-21].研究發現當P21表達被阻滯時，地西他濱誘導細胞G2期阻滯[22].P27和P21一樣可以與CCND1-CDK4/6復合物相互作用[23]，但是會造成對CCNE-CDK2復合物抑制的阻斷[24].在本實驗中，EHP抑制腫瘤細胞HCT-15中突變P53的表達，同時導致P21和P27的表達降低，從而促進CDK2、Cyclin E1、CD1和Cyclin B1的表達，G1含量降低，誘導G2期阻滯.但CDK4和Cyclin D1蛋白表達卻下降，可能存在其他調節作用.

細胞凋亡是1種細胞程序性死亡，主要包括兩種途徑：死亡受體介導的凋亡途徑和線粒體介導的凋亡途徑[25].Caspase 9是細胞凋亡的發起者，充當調節細胞凋亡的多種蛋白激酶信號傳導途徑的焦點；Caspase 3 是細胞凋亡的主要執行者，多種凋亡刺激因子啟動不同的蛋白酶切割Caspase 3，使其激活，活化的Caspase 3進一步切割不同的底物，導致蛋白酶級聯反應放大，細胞走向凋亡；PARP是細胞凋亡核心成員半胱天冬酶(caspase)的切割底物，在DNA損傷修復與細胞凋亡中發揮著重要作用.有研究發現Oridinin以劑量依賴性活化Caspase 3，Caspase 9和PARP-1的切割，從而促進口腔鱗狀細胞癌的凋亡[27].在本實驗中，不同濃度EHP作用下，HCT-15發生凋亡作用，這與陽性藥CPT效果一致，同時用Caspase凋亡抑制劑Z-VAD-FMK進行凋亡抑制，EHP誘導凋亡得到緩解.接著檢測得出凋亡相關蛋白PARP 1、Caspase 9和Caspase3表達量均下降，且cleaved PARP、Caspase 9和Caspase 3 活性蛋白含量增加.說明EHP通過激活Caspase 9，從而進一步激活Caspase 3，在體內，PARP 1經Caspase 3剪切失去活性，無法對DNA進行修復，從而導致細胞穩態失衡，細胞發生凋亡.

綜上所述，本研究通過對硬毛常山中提取的單體化合物EHP進行抗結直腸癌HCT-15的研究，發現EHP通過調節P53通路，誘導HCT-15發生G2阻滯和凋亡作用，抑制增殖.該研究結論為(E)-6-(4-羥基苯基)庚-3-烯-2-酮(EHP)在結直腸癌中的作用機制以及新的治療藥物開發提供了新的理論資料.