竭香定痛膠囊治療冠心病網絡藥理學作用機制研究

曹寶國 劉惠娟 王新舜 王 恒 馬 琳 樊紅波

1.甘肅省天水市中醫醫院中醫內科，甘肅天水 741000；2.甘肅省天水市中醫醫院臨床藥學研究室，甘肅天水 741000；3.甘肅省天水市中醫醫院心內科，甘肅天水 741000

冠心病即冠狀動脈粥樣硬化性心臟病，是心臟冠狀動脈發生粥樣硬化引起官腔狹窄或閉塞而導致心肌缺血缺氧或壞死的心臟病，可嚴重危害人體健康，近年來，冠心病的發病率隨著人們生活水平的提高而逐漸上升[1-2]。竭香定痛膠囊是天水市中醫院臨床應用多年的中藥制劑（甘藥制備字Z20190402000），由血竭、檀香、三七、茯苓、細辛、冰片、琥珀及人參等八味藥組成，用于治療證屬血脈淤阻氣滯血瘀型的冠心病。天水市中醫院的多年臨床經驗表明，竭香定痛膠囊可有效改善冠心病急性發作期的心前區疼痛、胸悶、氣短、乏力心悸等癥狀，并有效降低C 反應蛋白及低密度脂蛋白[3-4]。

網絡藥理學是現代計算機技術與生物醫藥發展相融合的一門新興技術，其通過分析藥物、靶點與疾病之間的相互作用，借助節點的連接和關系，闡明中藥組分-疾病靶點作用機制[5]。本研究運用網絡藥理學的方法，分析竭香定痛膠囊治療冠心病的作用機制，以期為竭香定痛膠囊的進一步臨床應用研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 竭香定痛膠囊有效成分及作用靶點獲得

在中藥系統藥理學數據庫（即計算機系統生物學實驗室，traditional Chinese medicine systems pharmacology databaseand analysis platform，TCMSP，網址：http://tcmspw.com/tcmsp.php）中篩選竭香定痛膠囊藥物組方的有效成分，篩選條件如下：所篩選的每味藥有效成分的口服生物利用度（oral bioavailability，OB）＞30%，類藥性（drug-likeness，DL）＞0.18。復制所有藥物組方的全部作用靶點基因（relate targets），應用Perl Critic 軟件交互與有效成分相關的靶基因，并剔除無名稱基因。

1.2 冠心病靶點的獲得及藥物-疾病共有基因獲得

以“Coronary heart disease”為關鍵詞在OMIM數據庫（https://omim.org/search/advanced/geneMap）及GeneCards 數據庫（https://www.genecards.org/）中檢 索疾病基因靶點并匯總。采用R 語言x64 4.0.1 版本軟件對所得藥物有效成分靶點與疾病靶點進行映射分析，獲得藥物-疾病共有基因。

1.3 中藥調控及蛋白質相互作用網絡構建

應用Perl 軟件分析所得藥物-疾病共有基因的網絡，再采用網絡拓撲屬性分析軟件Cytoscape 對中藥調控網絡進行可視化分析，構建疾病-有效成分-作用靶點的三元調控網絡圖。

將藥物-疾病共有基因結果導入STRING 數據庫（https://string-db.org/）Multiple proteins 中，物種選擇“Homo sapiens”，設置“higher confidence 0.700”，隱藏游離節點，以構建蛋白質相互作用（protein-protein interaction，PPI）網絡。

1.4 基因本體功能富集和基因組百科全書通路富集

采用R 語言x64 4.0.1 版本軟件bioconductor BiocManager 程序包將藥物-疾病交互基因轉化為Gene ID，利用bioconductor 中“DOSE”“clusterProfiler”及“pathview”程序包，應用該軟件對所得Gene ID 進行基因本體（gene ontology，GO）功能富集富集和基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析，設置Pvalue Cutoff 及Qvalue Cutoff均為0.05。

2 結果

2.1 竭香定痛膠囊有效成分及作用靶點基因篩選

在TCMSP 篩選出竭香定痛膠囊共59 個有效成分，4747 個藥物相關靶基因，采用Perl Critic 軟件篩選剔除無名稱基因，共得到36 個有效成分的804 個基因。

2.2 中藥-疾病共有基因獲得

以“Coronary heart disease”為關鍵詞在OMIM 數據庫及GeneCards 數據庫中共檢索冠心病基因靶點8488 個（去重后7453 個），應用R 語言將其與竭香定痛膠囊有效成分靶點基因進行交集，得竭香定痛膠囊藥物組分-冠心病共有基因100 個（圖1）。

圖1 竭香定痛膠囊治療冠心病的靶點韋恩圖

2.3 中藥調控及PPI 網絡構建

采用Cytoscape 3.6.1 軟件構建冠心病-竭香定痛膠囊-作用靶點的的三元調控網絡圖（圖2，封四），結果顯示，共有竭香定痛膠囊通過36 種有效成分作用于100 個中藥-疾病共同靶點，有效成分為：山柰酚（kaempferol）、異鼠李素（isorhamnetin）、木犀草素（luteolin）、槲皮素（quercetin）、異牡荊素（isovitexin）、常春藤皂苷（hederagenin）、豆甾醇（stigmasterol）、β-谷甾醇（β-sitosterol）、人參皂苷Rh2（ginsenoside Rh2）等。

圖2 冠心病-竭香定痛膠囊-作用靶點的的三元調控網絡圖

將所得100 個竭香定痛膠囊與冠心病共有基因導入STRING 中，選擇高度相關性（high confid ence 0.700）獲得PPI 網絡圖（圖3，封四），結果顯示，其中含有100 個共有基因節點及390 條邊，PPI 富集后P 值為＜1.0e-16，表明所建立的PPI 網絡較預期的互動更為顯著。

圖3 竭香定痛膠囊與冠心病PPI 網絡圖

采用R 語言軟件分析PPI 網絡中排名前30 位的靶點，縱向為基因名稱，橫向為基因鏈接節點數目，結果見圖4，由圖可知絲裂原激活蛋白激酶8（mitogenactivated protein kinase 8，MAPK8）基因鏈接節點數目最大，為32，其次為表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）、白細胞介素-6（intedeukin-6，IL-6）連接點數目均為26，雌激素受體基因1（estrogen receptor gene 1，ESR1）及血管內皮生長因子A（vascular endothelial growth factor，VEGFA）基因排名第四，連接點為25，其他基因是胱天蛋白酶3（CASP3）、MYC、細胞周期素D1（cyclin D1，CCND1）及過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferators activate the receptor γ，PPARG）等。

圖4 竭香定痛膠囊與冠心病交互作用條形圖

2.4 GO 及KEGG 富集分析

在R 語言中安裝“DOSE”“clusterProfiler”及“pathview”程序包，將所得drug-disease 轉化為Gene ID，并對所得Gene ID 進行GO 及KEGG 富集分析，得GO條目126 條，KEGG 通路116 條（P 值、Q 值均＜0.05），選用前20 條，分別得GO 及KEGG 富集柱狀圖及氣泡圖。

GO 富集分析柱狀圖及氣泡圖結果見圖5（封四），結果顯示，竭香定痛膠囊-冠心病共有基因涉及人體功能包括：核受體的活動、配體激活的轉錄因子活性、類固醇激素受體活性、DNA 結合轉錄因子結合、RNA聚合酶Ⅱ特異性DNA 結合轉錄因子結合、 半胱氨酸型內肽酶活性參與凋亡過程、氧化還原酶活性、泛素樣蛋白連接酶結合、單氧酶活動、核激素受體結合、雌激素受體結合、泛素蛋白連接酶結合等功能。

圖5 GO 富集圖

KEGG 通路富集分析柱狀圖及氣泡圖結果見圖6（封四），竭香定痛膠囊有效成分作用于冠心病的部分通路基因靶點的結果見圖7。結果顯示，竭香定痛膠囊有效成分作用靶基因參與疾病調控，涉及PI3K-Akt 信號通路、 液體剪切應力和動脈粥樣硬化、乙型肝炎、糖尿病并發癥中AGE-RAGE 信號通路、細胞凋亡信號通路、卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染信號通路、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）信號通路、人類巨細胞病毒感染信號通路、甲狀腺激素信號通路等。

圖7 竭香定痛膠囊治療冠心病KEGG 富集中的部分信號通路

3 討論

冠心病屬于中醫“胸痹”的范疇，胸痹是一本虛標實之證，正虛（心氣虛和心陰虛）是其內因，氣滯、血瘀、痰濁是冠心病的繼發因素[6-7]。竭香定痛膠囊是天水市中醫醫院從“調脾護心，溫陽活血”治療原則出發，總結出的冠心病治療經驗制劑，由人參、茯苓、血竭、三七、冰片、檀香、細辛及琥珀八味藥組成，全方共奏調脾護心、溫陽活血、通脈定痛之功。

本文通過網絡藥理學分析，顯示竭香定痛膠囊中共36 個有效成分作用于冠心病基因靶點，其中槲皮素（quercetin）、山柰酚（kaempferol）、異鼠李素（isorhamnetin）、木犀草素（luteolin）、異牡荊素（isovitexin），常春藤皂苷（hederagenin）、豆甾醇（stigmasterol）、β-谷甾醇（β-sitosterol）、人參皂苷Rh2（ginsenoside Rh2）等有效成分基因靶點數目較多?，F代藥理學研究表明，槲皮素可通過上調細胞內14-3-3 η 蛋白表達水平，穩定線粒體膜電位，抑制mPTP 開放，最終減少細胞凋亡，達到抗心肌缺血再灌注損傷[8-9]，而山奈酚（kaempferol）、槲皮素（quercetin）和異鼠李素（isorha mnetin）可以顯著抑制細胞分化終末期的關鍵轉錄因子PPARG、重組人CCAAT 增強子結合蛋白（recombinant human CCAAT enhancer binding protein，C/EBPα）和固醇調節元件結合蛋白-1c（sterol regulatory element binding protein-1c，SREBP-1c）的表達，而影響其下游與脂質合成相關的酶和蛋白的轉錄水平表達[10-11]。此外，豆甾醇（stigmasterol）、β-谷甾醇（β-sitosterol）等植物甾醇，作為膽固醇類似物可抑制膽固醇腸道吸收，進而降低血液中膽固醇水平、降低心血管疾病風險[12-13]。另外，人參皂苷對缺氧誘導心肌細胞損傷具有一定保護作用[14]。

中藥-疾病-基因三元調控網絡及PPI 網絡結果顯示，竭香定痛膠囊通過以上多種成分作用于MAPK8、EGFR、IL-6、ESR1、VEGFA、CASP3、MYC、CCND1 及PPARG 等100 個基因。其中MAPK8 鏈接點數目最大，MAPK8 是促分裂原活化的蛋白激酶家族中的一員，又稱為JNK1/SAPK1 基因，是MAPK 信號轉導途徑中重要的信號分子，涉及細胞增殖、分化、凋亡等各種機制[16]。研究表明，MAPK8 是TNF-α 促進脂肪細胞凋亡、抑制脂肪細胞分化、促進成熟脂肪細胞去分化、 促進細胞內脂解等作用的上游重要信號分子[17]，MAPK8 可通過誘導線粒體釋放細胞色素C 而啟動死亡信號途徑和細胞凋亡，并可降低分化脂肪細胞抗凋亡特性[17]。而KEGG 富集的信號通路包含細胞凋亡途徑、TNF-α 途徑，提示竭香定痛膠囊可能通過以上途徑上調MAPK8 基因表達，促進脂肪細胞凋亡，進而減少脂肪細胞的分化成熟和聚集。

此外，VEGF 及ESR1 基因與冠心病相關，如VEGFA 基因多態性可增加冠心病風險，已經證實雌激素受體的基因ESR1 和ESR2 降低雌激素對心血管功能的編碼，它們分別編碼了ERα 和ERβ，其中前者參與血管舒張、心肌細胞凋亡、刺激新血管的形成[18-19]，而在絕經后婦女冠心病的發生中，ERα 參與調節的miR-214 可以抑制VEGF 的表達和生理功能，通過調控VEGF 來影響絕經后婦女冠心病的發病過程[20]。本文GO 和KEGG 富集結果顯示，竭香定痛膠囊涉人體類固醇激素受體活性、雌激素受體結合活動及流體剪切應力和動脈粥樣硬化等信號通路，從而發揮治療冠心病的作用，提示竭香定痛膠囊有效成分，可能通過以上基因途徑達到治療冠心病的目的。

綜上所述，竭香定痛膠囊治療冠心病時存在多分子、多基因靶點及多通路協作機制，可能通過槲皮素（quercetin）、山柰酚（kaempferol）、異鼠李素（isorhamnetin）、木犀草素（luteolin）等多種成分調控MAPK8、EGFR、IL-6、ESR1、VEGFA 基因蛋白的表達，從而影響人體核受體的活動，配體激活的轉錄因子活性、類固醇激素受體活性、半胱氨酸型內肽酶活性參與凋亡過程、氧化還原酶活性、雌激素受體結合、泛素蛋白連接酶結合等功能、氧化還原酶活性（減少氧分子），并調控PI3K-Akt 信號通路、 液體剪切應力和動脈粥樣硬化通路、TNF 信號通路及細胞凋亡通路等多種方式治療冠心病。