煙草青枯病抑病型土壤中有益微生物的組成分析

黎妍妍，李春黎，楊小瓊，陳守文，李錫宏*，楊 勇*

1. 湖北省煙草科學研究院，武漢市硚口區寶豐路6 號香溢大酒店4 樓 430030

2. 湖北大學生命科學學院，武漢市武昌區友誼大道368 號 430062

煙草青枯病是由土傳病原菌青枯勞爾氏菌（R.solanacearum）引起，每年給煙葉生產造成巨大的產量和經濟損失［1-2］。因此煙草青枯病防治也成為煙葉生產中亟待解決的問題和研究熱點。有研究表明，一些土傳病害發生區域中存在發病較輕或不發病的地塊，稱為抑病型土壤（Suppressive soil）［3-4］。在這種土壤中病原菌不易定殖，或雖能定殖但危害很小或不產生危害，或能定殖并一時造成危害但隨后即使在病原菌存在的情況下發病也很輕。與之相對應的是導病型土壤（Conducive soil），即易發生病害的土壤。在抑病型土壤中，土壤微生物的數量、生物量、多樣性及活性等與土壤抑病性有關。Mendes等［5］試驗證實在立枯絲核菌（R. solani）抑病型土壤中存在大量的變形菌、厚壁菌和放線菌，植物在受到病原菌侵染時，可利用這些微生物群落保護自己并抵抗病原菌的侵染。沈宗專［6］和鄧照亮［7］研究發現香蕉枯萎病及連作園抑病型土壤中芽胞桿菌屬（Bacillus）、酸桿菌屬（Acidobacterium）、木霉菌屬（Trichoderma）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、鏈霉菌屬（Streptomyces）的相對豐度顯著高于導病型土壤，而致病菌鐮刀菌屬（Fusarium）的相對豐度卻顯著低于導病型土壤。可見，抑病型土壤的抑病能力與土壤中特定的有益微生物富集有關［8］。目前，關于青枯病抑病型和導病型土壤的相關研究主要集中在兩種類型土壤中微生物結構的差異等方面［9-10］，而對于其中有益微生物的差異分析方面則鮮見報道。為此，對連作多年的煙草青枯病抑病型煙田和導病型煙田進行了青枯病發病情況調查及土壤中有益和致病微生物的組成分析，以期為挖掘青枯病拮抗微生物資源提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗地點及樣品采集

供試土壤取自湖北省宣恩縣（北緯29.97°，東經109.38°）煙田，連續種植煙草（云煙87）15 年以上。選擇海拔500 m（L500）、900 m（L900）和1 300 m（L1300）的種植區域，每區域包含抑病型土壤（SS）和導病型土壤（CS）各1 塊。于煙草移栽后70 d，按照五點取樣法采集煙株根際土壤。依據海拔高度和土壤類型，所采集樣品分別標記為L500SS、L900SS、L1300SS和L500CS、L900CS、L1300CS。每田塊3次重復，共計采集18個土樣。土樣混勻后，將其置于干冰中帶回實驗室，保存于-80 ℃冰箱中，用于后續DNA的提取。

1.2 煙草青枯病病情調查

在采集土壤樣品的同時，調查煙草青枯病的發生情況。以株為單位，調查每株煙發病情況，并計算發病率。

1.3 土壤微生物群落分析

1.3.1 DNA提取和PCR擴增

土壤總DNA 利用FastDNA Spin Kit 試劑盒（美國MP Biomedicals 公司）進行提取，DNA 提取后經PCR擴增，所得產物檢測合格后進行文庫構建，由諾禾致源生物信息科技有限公司通過Illumina Hiseq PE250 測序平臺測序，具體方法參考文獻［11］。

1.3.2 OTU聚類與物種注釋

所有樣品的Effective Tags 進行聚類后以97%的一致性將序列聚類成為OTUs。參考文獻［11］進行細菌物種和真菌物種的注釋分析。

1.4 數據處理

用SPSS 19.0 中的T 檢驗分析煙草青枯病發病率差異，用R軟件中的Amova（Analysis of molecular variance）分析土壤微生物群落組成的差異。

2 結果與分析

2.1 煙草青枯病的發病情況分析

對不同海拔高度下抑病型和導病型土壤煙草青枯病發病情況進行調查。結果（圖1a和圖1b）表明，L500、L900 和L1300 抑病型煙田煙草青枯病發病率分別為4.657%、3.573%和2.893%，土壤中青枯病原菌的相對豐度分別為 6.10×10-4、5.10×10-4和 3.60×10-4；L500、L900 和 L1300 的導病型煙田煙草青枯病發病率分別為32.853%、26.392%和21.893%，土壤中青枯病原菌的相對豐度分別為3.57×10-3、2.97×10-3和2.39×10-3。同一海拔高度下抑病型煙田煙草青枯病發病率和土壤青枯菌相對豐度均極顯著（p＜0.01）低于導病型土壤。

圖1 抑病型和導病型土壤青枯病發病率（a）和青枯菌相對豐度變化（b）Fig.1 Incidence of bacterial wilt（a) and the relative abundance of R. solanacearum（b）in disease-suppressive soils（SS)and disease-conducive soils（CS）

2.2 土壤微生物群落結構變化

圖2可知，在500 m、900 m和1 300 m海拔高度下抑病型和導病型土壤中微生物群落結構存在明顯差異，變形菌門（Proteobacteria）、子囊菌門（Ascomycota）和擔子菌門（Basidiomycota）的相對豐度在導病型土壤中較高，放線菌門（Actinobacteria）、藍藻門（Cyanobacteria）、厚壁菌門（Fimicutes）、壺菌門（Chytridiomycota）和接合菌門（Zygomycota）的相對豐度在抑病型土壤中較高。基于Bray-Curtis 算法，通過Amova 分析了同一海拔高度下抑病型和導病型土壤中微生物群落的差異顯著性，結果（表1）表明細菌門類豐度差異不顯著，而真菌門類豐度存在顯著性差異。

圖2 門水平上抑病型和導病型土壤中細菌和真菌群落的組成Fig.2 Bacterial and fungal community structures in disease-suppressive soils（SS）and disease-conducive soils（CS）at phylum level

表1 抑病型和導病型土壤中細菌和真菌門類豐度差異分析Tab.1 Differential analysis of bacterial and fungal abundances in disease-suppressive soils（SS)and disease-conducive soils（CS) at phylum level

對不同海拔高度下抑病型和導病型土壤中細菌和真菌群落屬水平上的差異進行分析，結果（圖3）表明，500 m 海拔高度下，抑病型土壤中無色桿菌屬（Achromobacter）、德沃斯氏菌屬（Devosia）和微桿菌屬（Microbacterium）的相對豐度顯著低于導病型土壤（圖3a），而木霉菌屬（Trichoderma）真菌的相對豐度顯著高于導病型土壤（圖3b）。900 m海拔高度下，土壤中芽單胞菌屬（Gemmatimonas）、鞘脂菌屬（Sphingobium）、鞘脂單胞菌屬（Sphingopyxis）和貪銅菌屬（Cupriavidus）為具有顯著差異的細菌類群，毛殼菌屬（Chaetomium）、被孢霉屬（Mortierella）和短梗蠕孢屬（Trichocladium）為具有顯著差異的真菌類群；其中，抑病型土壤中芽單胞菌屬（Gemmatimonas）、鞘脂菌屬（Sphingobium）、鞘脂單胞菌屬（Sphingopyxis）和毛殼菌屬（Chaetomium）的相對豐度顯著低于導病型土壤，貪銅菌屬（Cupriavidus）、被孢霉屬（Mortierella）和短梗蠕孢屬（Trichocladium）的相對豐度顯著高于導病型土壤（圖3c 和圖3d）。1 300 m 海拔高度下，抑病型和導病型土壤中勞爾氏菌屬（Ralstonia）、無色桿菌屬（Achromobacter）、中慢生根瘤菌屬（Mesorhizobium）、亞硝化螺菌屬（Nitrosospira）和Gemmatirosa 等5 個細菌屬的相對豐度存在顯著差異（圖 3e），木霉菌屬（Trichoderma）、被孢霉屬（Mortierella）等10 個真菌屬的相對豐度存在顯著差異（圖3f）。

圖3 抑病型和導病型土壤中屬水平上細菌和真菌組成差異顯著分析Fig.3 Significance analysis of differences between bacteria and fungi in disease-suppressive soils（SS)and disease-conducive soils（CS）at genus level

2.3 青枯菌拮抗菌相對豐度及與青枯病發病率的相關性

目前已報道的青枯病拮抗菌有100多株［12］，主要包括細菌型拮抗菌類，如類芽胞桿菌（Paenibacillus）、鏈霉菌（Streptomyces）、紅假單胞菌屬（Rhodopseudomonas）、鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas）、嗜麥芽窄食單胞菌（Stenotrophomonas）、金黃桿菌（Chryseobacterium）、梭狀芽胞桿菌（Clostridium）、黃桿菌（Flavobacterium）、芽胞桿菌（Bacillus）、叢生放線菌（Actinospica）、細 鏈 胞 菌（Catenulispora）、Haliangium和溶桿菌（Lysobacter）等［6,13-17］以及真菌型拮 抗 菌 類 ，如 曲 霉 菌（Aspergillus）、青 霉 菌（Penicillium）、淡色生赤殼菌（Bionectria）、漆斑菌（Myrothecium）、木霉菌（Trichoderma）、巨孢囊霉（Gigaspora）和盾巨孢囊霉（Scutellospora）等［18-21］。根據土壤微生物群落結構組成，對已報道的拮抗菌的相對豐度進行分析，結果（圖4）表明，拮抗細菌假單胞菌屬（Pseudomonas）、黃桿菌屬（Flavobacterium）、根瘤菌屬（Rhizobium）、黃單胞菌（Xanthomonas）、細鏈胞菌屬（Catenulispora）和拮抗真菌曲霉菌屬（Aspergillus）、漆斑菌屬（Myrothecium）和木霉菌屬（Trichoderma）在3 種海拔高度抑病型土壤中的相對豐度均顯著高于導病型土壤；500 m和900 m海拔高度下，嗜麥芽窄食單胞菌屬（Stenotrophomonas）、盾巨孢囊霉屬（Scutellospora）在抑病型土壤中的相對豐度均顯著高于導病型土壤。對拮抗菌的相對豐度與青枯病發病率的相關性進行了分析，結果顯示這些拮抗菌的相對豐度與青枯病發病率呈負相關，且假單胞菌屬（Pseudomonas）、根瘤菌屬（Rhizobium）、黃單胞菌屬（Xanthomonas）、嗜麥芽窄食單胞菌屬（Stenotrophomonas）、曲霉菌屬（Aspergillus）、漆斑菌屬（Myrothecium）和木霉菌屬（Trichoderma）的相對豐度與青枯病發病率間的相關性總體達到顯著水平，見表2。

表2 不同海拔條件下拮抗微生物相對豐度與煙草青枯病發病率的Pearson相關性①Tab.2 Pearson correlations between relative abundances of antagonistic microorganisms and incidence of tobacco bacterial wilt at different altitudes

圖4 抑病型和導病型土壤中拮抗微生物的相對豐度Fig.4 Relative abundances of antagonistic microorganisms in disease-suppressive soils（SS）and disease-conducive soils（CS）

3 討論

本研究中通過擴增子測序技術探究了煙草導病型土壤和抑病型土壤中細菌和真菌群落的結構變化，分析了致病微生物和有益微生物的差異。致病細菌Ralstonia的相對豐度在導病型土壤明顯高于抑病型土壤。除導病微生物外，抑病型土壤和導病型土壤中有益微生物差異較大。有益微生物能刺激植物根部生長、進行根際修復、調控非生物脅迫和控制病害等［22］。

在門水平上，抑病型土壤和導病型土壤微生物豐度和結構發生了明顯的動態變化。與導病型土壤相比，抑病型土壤中變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、擔子菌門（Basidiomycota）的相對豐度下降，放線菌門（Actinobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、藍藻門（Cyanobacteria）、接合菌門（Zygomycota）、壺菌門（Chytridiomycota）的相對豐度升高。在細菌門中，厚壁菌門（Firmicutes）中的芽胞桿菌產生抑制病原菌的抗菌脂化合物；放線菌門（Actinobacteria）中的鏈霉菌產生抗生素和揮發性物質具有抗真菌的作用［23］；Lee等［24］證明土壤根際中的厚壁菌門和放線菌門在病害抑制中起關鍵作用。真菌門中，壺菌門（Chytridiomycota）的大多數種類能分解纖維素和幾丁質，促進土壤碳氮循環［25］。因此，抑病型土壤中含有的有益微生物群體對防控植物病害發揮著十分重要的作用。

從屬水平上分析，抑病型土壤中中慢生根瘤菌屬（Mesorhizobium）、亞硝化螺菌屬（Nitrosospira）、貪銅菌屬（Cupriavidus）等細菌屬和被孢霉屬（Mortierella）、短梗蠕孢屬（Trichocladium）、木霉菌屬（Trichoderma）等真菌屬的相對豐度顯著高于導病型土壤。其中，中慢生根瘤菌屬（Mesorhizobium）通過固定空氣中的氮氣，可將其轉化成植物可利用吸收的化合態氮［26］，亞硝化螺菌（Nitrosospira）可以參與土壤中氮的循環［27］，土壤接種被孢霉屬（Mortierella）能夠促進植物幼苗根系對磷和鉀的吸收［28］，而木霉菌屬（Trichoderma）可以產生真菌細胞壁降解酶和次生代謝產物等生物活性物質，對多種病原真菌具備較強的拮抗作用［29］。由此可見，在受到病原菌侵染時，不同的微生物發揮各自的功能，調節根際土壤微生物群落，共同達到抗菌促生的作用［30］。關于土壤中青枯菌的拮抗微生物的分析結果表明，青枯菌的拮抗菌 根 瘤 菌 屬（Rhizobium）、黃 單 胞 菌 屬（Xanthomonas）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、黃桿菌屬（Flavobacterium）、嗜麥芽窄食單胞菌屬（Stenotrophomonas）、曲霉菌屬（Aspergillus）、漆斑菌屬（Myrothecium）、木霉菌屬（Trichoderma）等在抑病型土壤中具有較高的相對豐度，且其相對豐度與青枯病的發病率具有負相關關系。這也說明了對煙草青枯病起主要防控作用的是拮抗菌類微生物［11］。

綜合分析得出，煙草抑病型土壤中存在多種青枯菌的拮抗菌，可以顯著降低青枯菌的豐度，減少青枯病的爆發。因此在土傳病害的生物防治中，通過分析抑病型土壤中優勢微生物的種類，篩選并應用抑病型土壤中的拮抗菌，既可達到防治土傳病害的目的，也可實現土壤資源的合理利用。

4 結論

煙草青枯病導病型土壤與抑病型土壤中微生物群落差異顯著，在門水平上，細菌門類無明顯差異，真菌門類具有顯著性差異。在屬水平上，致病微生物勞爾氏菌屬（Ralstonia）在導病型土壤中具有較高的相對豐度，而有益微生物中慢生根瘤菌屬（Mesorhizobium）、亞硝化螺菌屬（Nitrosospira）及青枯菌拮抗微生物假單胞菌屬（Pseudomonas）、黃桿菌屬（Flavobacterium）、根瘤菌屬（Rhizobium）、黃單胞菌屬（Xanthomonas）、嗜麥芽窄食單胞菌屬（Stenotrophomonas）等的相對豐度在抑病型土壤中顯著高于導病型土壤，且這些拮抗微生物與青枯病的發病率呈負相關。