液相色譜-串聯質譜聯用儀器管理與維護

王倩(南京中醫藥大學科技實驗中心, 江蘇 南京 210046)

0 引言

液相色譜(LC)是根據目標化合物在色譜柱中保留時間的差異，并將化合物從混合物中分離出來，進行收集及檢測的儀器[1-2]。質譜(MS)是把分子轉化成氣態離子，并根據質荷比(M/Z : M質量數，Z電荷數)的差異把離子進行分離檢測的儀器[3]。液相色譜-串聯質譜(LC-MS/MS)在過去的10～15年里在臨床實驗室取得了巨大的增長。對低分子量分析物，它具有優于免疫分析法或傳統的高效/壓力液相色譜(HPLC)的分析特異性，并且比氣相色譜-質譜(GC-MS)具有更高的通量[4]。為更好地延長儀器壽命、降低耗材成本并維持儀器的良好狀態，獲得更可靠的分析數據，儀器的日常維護及保養至關重要。以下以島津公司CTO-30A高效液相色譜與AB SCIEX公司QTRAP 4500質譜聯用為例，從儀器結構特點出發，結合日常工作，總結使用過程中的常見問題及經驗進行闡述。

1 培訓與管理

1.1 儀器預約與管理

平臺目前采用線上預約的方式進行儀器的培訓以及預約使用申請。HPLC-QTRAP 4500 液質聯用儀是實驗室大型分析儀器，應有專業技術人員專門管理。通常采用送樣測試的方式進行日常的分析測試工作。通常情況下，在預約測試樣品前，送樣人員應與儀器管理者進行有效溝通，常見于探討儀器本身是否可以滿足實驗目的。確定可行性后就分析測定的化合物性質、樣品的前處理方法、色譜柱的選擇、流動相的配制以及耗材的準備等方面再進行進一步的方法制定。在預約規定的時間，送檢人員將所需測定的樣品提供給儀器管理者進行上機測定，樣品測定完成后，儀器管理員進行數據處理和分析，并將檢測結果用格式化的光盤進行存儲并將實驗數據轉交給送樣人員。液質聯用儀是大型分析精密儀器，在日常的使用中若因樣品處理不當或者操作不當，輕則造成儀器污染導致儀器壽命縮短，重則損壞儀器從而花費高額的維修費用。因此，需要儀器管理人員專門進行操作。然而，因液質聯用儀應用廣泛，日常需測定的樣本量巨大，服務的人員眾多，儀器管理人員難以做到事無巨細。因此，平臺每年都會舉辦液相色譜質譜聯用儀器理論及操作培訓，主要以開展講座以及儀器上機培訓為主。包括但不限于介紹儀器的基本原理、儀器在使用過程中遇到的問題及解決方案、數據的處理以及結果的分析等方面。對培訓合格以及多次考核均滿足要求者，方可允許其獨立進行儀器的操作。獨立使用儀器者必須嚴格遵守質譜儀器實驗室制定的相關規章制度，嚴格按照培訓的操作規程使用儀器。樣本如需要過夜進樣時需與儀器管理人員報備。操作者若違反質譜實驗室規定而造成儀器故障并影響性能者，將被取消儀器使用資格。在使用過程中儀器出現任何問題或者故障，儀器使用者應及時通知儀器管理員，采取相應措施進行補救以免對儀器造成更嚴重的損害。

1.2 樣品前處理

明確樣品類型是送樣人員首先要提供給儀器管理者的信息，針對不同的樣品類型，如生物樣本、藥用植物、食品及化妝品等前處理方法是有區別的。除此之外，樣品溶液要排除含有生物大分子、無機酸、難揮發的鹽、表面活性劑等。此外，樣品只限于甲醇、乙腈、水中的一種或者其組合進行樣品溶解，離心后并采用0.22 μm的濾膜過濾(注意：水系膜與有機系膜選用區別)，特殊情況下如樣品量較少無法完成濾膜過濾，應采用高速離心機4 ℃條件下12 000 r/min離心10 min后取上清液進行進樣分析。確保樣品溶液透明且無沉淀等現象。鑒于質譜的靈敏度高，防止因溶劑的雜質較多影響實驗結果的準確性。選用溶劑溶解樣品時要注意其純度，如甲醇/乙腈選用包裝明確標注為質譜級或色譜級溶劑，水要選用一級水。為了防止因樣品濃度過高造成色譜柱殘留或者離子源污染等情況的發生，樣品的濃度應控制在小于1 μg/mL最佳。

2 日常使用與保養

2.1 環境要求

液質聯用儀器的正常運行對環境要求較為苛刻，儀器周圍的電磁感應裝置會影響液質聯用儀器正常運行。因此需要維持環境溫度在20～24 ℃，濕度保持在35%～50%。一般日常室溫與最后一次校正時相差4 ℃以內。并且需要保證溫度的變化率小于2 ℃/h。若環境溫度變化率過大，會造成質譜儀質量軸偏移，分析測定結果不準確。另外，質譜儀房間一定要妥善保持通風，實驗室良好的通風環境用以控制有機試劑等有毒有害物質排放，保證儀器正常運行。除此之外，實驗室日常要進行除塵工作，防止房間灰塵過多造成質譜儀電路板短路等情況的發生。

2.2 液相色譜系統

2.2.1 流動相

液相色譜系統作為質譜的進樣系統有著不可忽視的作用。液相色譜質譜聯用時，流動相的選擇至關重要。盡量選用質譜(MS)級別的甲醇/乙腈作為有機相，若流動相為色譜(HPLC)級，應采用0.22 μm有機系濾膜過濾后使用。嚴禁采用分析級及更低純度的甲醇/乙腈作為流動相，流動相中嚴禁含有難揮發的鹽類，如磷酸鹽、硼酸鹽等；流動相中嚴禁使用含有抑制化合物電離的表面活性劑；嚴禁使用鹽酸、硫酸等無機酸。配備完成的流動相應先進行脫氣，一般超聲5 min左右就可以完成脫氣的目的。一般水相做到現配現用，有機相可保存1個月左右。若流動相含有鹽類，在每次實驗結束后應先采用高比例的純水進行沖洗，然后逐漸升高有機相比例，此操作的目的是將殘存的鹽類排出，避免腐蝕管路系統。

2.2.2 色譜柱

液質聯用儀與單獨的液相色譜儀相比，顯著的區別在于配備的色譜柱較短以及流速的相對較低。以便樣品在進入離子源時能夠完成很好的電離。因此，在實驗開始前應根據所測化合物的性質選擇合適的色譜柱，包括色譜柱長度、粒徑大小、填料種類、pH值范圍、所耐受的壓力以及其與后方質譜的兼容性等問題。

對新購買的色譜柱，首次使用前應進行活化，以常用的普通反相C18色譜柱為例，一般采用0.5 mL/min的甲醇進行沖洗大約120 min，然后更換流動相進行平衡操作。建議實驗開始前及實驗結束后都應進行色譜柱的沖洗，一般先用高比例純水，約90%的純水/甲醇體系進行色譜柱的沖洗，然后逐漸提高有機相比例，最后色譜柱保存在純甲醇中。注意沖洗色譜柱時應斷開與質譜的管路連接，防止將污染物沖進離子源導致離子源污染。在色譜柱沖洗完成后，用二通替換色譜柱，然后用50%甲醇/水以1 mL/min流速沖洗質譜儀約30 min左右。若長時間不使用此色譜柱，為防止甲醇揮發，造成色譜柱的柱效下降，應將其保存在高比例有機相，如90%甲醇/水體系中為宜。

2.3 三重四極桿質譜

2.3.1 離子源

質譜在工作過程中為了減少高速電子和離子與其他分子之間碰撞導致的能量消耗，離子必須處于高真空狀態。因此維持離子源及質量分析器的高真空度是保證質譜儀能夠正常運行的必要條件。機械泵的狀態直接關系到離子源的真空度能否達到既定要求。因此，應注意觀察機械泵的泵油顏色是否變深，泵油的體積是否控制在距離刻度線約三分之二處。每隔三年或者泵油顏色變深變暗時更換泵油為宜。應每日進行離子源流路清洗。每周進行離子源內腔清洗以及機械泵油量檢查。每月進行一次機械泵濾網清潔，每年進行一次儀器除塵工作。除此之外，當噴霧針堵塞時應及時更換，當儀器靈敏度或者分辨率下降時應進行離子參數的優化。

2.3.2 質量分析器

四極桿質量分析器是由四根平行的金屬桿組成，四極上加的直流電壓和射頻電壓比值通常是一個常數，代表儀器的分辨率[5]。四極桿質量分析器的靈敏度和分辨率也存在反比例關系，即提高分辨率的同時會降低其靈敏度[6]。當儀器在正常工作時只要改變直流電壓和射頻電壓值而不改變其比值，就能實現不同質核比的離子檢測。當儀器長時間工作或者進行多種分析化合物測定后，通常會導致質量數或多或少的偏差，造成質譜儀靈敏度下降，因此，應定期進行儀器的校正，防止質譜質量軸偏差，造成測試結果的不準確。

3 常見故障排查

3.1 色譜圖異常

一般情況如泵引起的脈沖或者梯度洗脫可能造成色譜圖背景高，此時需要優化梯度洗脫條件。除此之外流動相污染時可觀察到背景隨著流動相梯度變化而變化，有時還會“出峰”，此時需要更換流動相，改用級別更高的溶劑。當離子源污染時，可觀察到背景信號穩定，基本上不隨流動相梯度變化處理，此時需要清洗離子源，包括內腔、噴霧針尖端。當前幾個情況都處理過后，可嘗試更換管路或/和噴霧針等。當交叉污染發生時，可觀察到色譜圖空白也出峰，一般為進樣器污染。需要更換合適的樣品清洗液，此清洗液應能溶解樣品并將其從進樣針上洗掉。然后進行進樣針及進樣針座的清洗。

3.2 系統壓力異常

當系統壓力波動，呈“鋸齒”狀。可能是溶劑未脫氣，系統引入了氣泡。需將流動相進行脫氣，并排清儀器體系中的氣泡。除此之外，泵密封圈的老化也會造成系統壓力的波動。當系統壓力偏低，此時需逐一排查如溶劑進口過濾芯是否被堵、色譜柱兩端是否擰緊、色譜柱固定相是否流失、與質譜連接處管路是否漏液。當系統壓力偏高，此時需檢查系統中是否存在不溶性顆粒。將色譜柱拆下換上二通后觀察壓力是否正常。若壓力值在正常范圍內，則考慮為色譜柱堵塞。將色譜柱進行沖洗，完成后重新安裝測試，若壓力值較之前差別過大，則需更換色譜柱。將色譜柱拆下換上二通后觀察壓力若仍然偏高，則考慮進樣針堵塞可能性較大。可將進樣針切換至旁路，此時壓力若明顯下降，需要拆下進樣針，用50%異丙醇浸泡超聲清洗。

3.3 儀器污染處理

3.3.1 流動相污染

一般流動相的污染，特別是水相較容易污染，長時間放置會出現發霉長菌的情況，因此水相要選用一級水且現配現用。當流動相污染時，首先觀察到的是信號采集時的背景較高，也就是基線較高。需要更換干凈的流動相，或者是更換更高級別的流動相，一般有機相推薦質譜級、色譜級的有機相需用0.22 μm的濾膜過濾后使用。

3.3.2 色譜柱污染

當儀器檢測空白樣品時基線過高，并且有響應較高的色譜峰出現時，排除了流動相污染的情況下，色譜柱的污染可能性很高。當在檢測過程中樣本量過大或者樣本濃度過高都會導致化合物在色譜柱中殘留。如果流動相用到鹽類，則需要先用10%的甲醇/水低流速進行沖洗，然后再換高比例甲醇過夜進行沖洗。否則可直接選擇用高比例甲醇低流速過夜沖洗。

3.3.3 離子源污染

當檢測的化合物濃度過高或者樣本量過大都會導致離子源污染。質譜的工作時間過長會導致非帶電殘留物污染離子源，這些污染物很難通過離子源的高速電磁場，也不能進入真空系統。離子源被污染形成的靜電涂層會引起電壓響應行為的改變，因此儀器的靈敏度會降低。為預防質譜噪聲高、信號不穩定，應每周進行一次離子源內腔，噴霧頭與噴霧針尖端的清洗。一般先在軟件中將質譜儀設置成待機模式，然后取下離子源，水平取出氣簾板(curtain plate)，用無塵紙蘸取50%甲醇/水擦拭內外表面，氮氣吹干。然后用甲醇濕潤的無塵紙沿一個方向擦拭錐孔板(orifice plate)外表面(需關機)。一張紙擦拭一次，擦拭三次，擦拭完后注意檢查錐孔中是否有纖維殘留。根據質譜的運行時間和樣品量種類，1～2周用50%甲醇/水擦拭離子源部腔體可降低數據圖譜背景信號。在沒有氣簾氣(curtian gas)輸入時，為了防止儀器吸入室內空氣污染內部離子傳輸元件，質譜主機最好關機，質譜關機時，保持氮氣供應，可以防止離子軌道受潮。

4 結語

液質聯用技術是用于檢測分析的重要手段。液質聯用儀器是屬于貴重精密儀器設備。目前已面向南京中醫藥大學全體師生開放，在日常的管理過程中，為避免出現儀器的損毀，保證儀器高效公平的為全校師生的教學科研提供服務，需要嚴格管控儀器的預約、樣品前處理、色譜柱維護、離子源及質量分析器的保養等工作。建立良好的管理方法，及時進行儀器的保養與維護能夠提高液質聯用儀器使用效率，節約分析時間，降低耗材成本，能夠得到可靠的分析數據。