柱前衍生-液相色譜法測(cè)定食品中牛磺酸含量的不確定度評(píng)定

◎ 趙夢(mèng)珂，謝嶠菲，田 燕，李永敏，李 瑩，王 蕊

（中檢科（北京）測(cè)試技術(shù)有限公司，北京 100123）

為保障舌尖上的安全和衛(wèi)生，食品生產(chǎn)企業(yè)必須在化學(xué)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)對(duì)食物的質(zhì)量指標(biāo)與安全參數(shù)進(jìn)行化學(xué)測(cè)試，檢測(cè)的結(jié)果將是企業(yè)制定產(chǎn)品品質(zhì)管理制度、執(zhí)法機(jī)關(guān)對(duì)食品安全實(shí)施有效監(jiān)督管理的重要依據(jù)。但是受客觀因素的影響，化學(xué)測(cè)定的結(jié)果會(huì)出現(xiàn)偏差[1]。為獲得更準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)，引入了不確定度這一概念來(lái)對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步的評(píng)價(jià)。不確定度是一種測(cè)量結(jié)果質(zhì)量的評(píng)定方式，這一概念包括了標(biāo)準(zhǔn)不確定度和擴(kuò)展不確定度。標(biāo)準(zhǔn)不確定度是由標(biāo)準(zhǔn)偏差來(lái)表示測(cè)量結(jié)果的不確定度；擴(kuò)展不確定度是以合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度的倍數(shù)表示的測(cè)量不確定度，可以確定測(cè)量結(jié)果的可疑范圍，表明測(cè)量值會(huì)在某一概率下（即置信水平）落入該區(qū)間范圍內(nèi)。目前國(guó)際上廣泛認(rèn)可測(cè)量不確定度這一參數(shù)，并推薦使用不確定度來(lái)定量說(shuō)明測(cè)量結(jié)果的質(zhì)量[2]。

測(cè)量不確定度評(píng)定在化學(xué)檢測(cè)的很多方面都有應(yīng)用[3-5]，如有些脂溶性維生素有最大限量，檢測(cè)結(jié)果在最大限量附近時(shí)，需要不確定度評(píng)定營(yíng)養(yǎng)素是否超出使用限量；有些毒素、添加劑不得檢出，檢測(cè)結(jié)果在檢出限附近時(shí)，需要不確定度評(píng)定有害物質(zhì)的風(fēng)險(xiǎn)；有些必須添加的維生素則有最小限量，檢測(cè)結(jié)果在最小限量附近時(shí)，需要不確定度評(píng)定營(yíng)養(yǎng)素的添加是否不足。在實(shí)驗(yàn)室很多方面的數(shù)據(jù)評(píng)定中，不確定度都能有所應(yīng)用。以牛磺酸為例，這種氨基酸在嬰幼兒的生長(zhǎng)以及發(fā)育的過(guò)程中起到了重要作用，但是不可過(guò)量也不能缺乏。因此，我國(guó)嬰幼兒食品2010版標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定牛磺酸的含量≤3.0 mg/100 kJ[6-8]，2021版標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定牛磺酸的含量在0.8～4.0 mg/100 kJ[9-11]。當(dāng)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)數(shù)值處于臨界值時(shí)，就體現(xiàn)了實(shí)驗(yàn)室不確定度對(duì)于判斷產(chǎn)品是否合格的重要意義。本文根據(jù)《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》（JJF 1059.1—2021）中不確定度的評(píng)定方法[12]，對(duì)GB 5009.169—2016第二法丹磺酰氯柱前衍生法[13]的檢測(cè)結(jié)果的不確定度進(jìn)行評(píng)定，希望能在實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制中加以應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

奶粉質(zhì)控樣品，貨號(hào)為QC-IP-707，購(gòu)自中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院測(cè)試評(píng)價(jià)中心；牛磺酸標(biāo)準(zhǔn)品，純度99.9%，購(gòu)自西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；乙腈（色譜純），購(gòu)自上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；冰乙酸、鹽酸、無(wú)水碳酸鈉、乙酸鈉、亞鐵氰化鉀和乙酸鋅（均為分析純），購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；鹽酸甲胺（分析純）、丹磺酰氯（色譜純），均購(gòu)自西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀：LC-20AT，島津企業(yè)管理（中國(guó)）有限公司；電子天平：ME204E，梅特勒托利多科技（中國(guó)）有限公司；超聲波提取器：KQ218，昆山市超聲儀器有限公司；pH計(jì)：FE28，梅特勒托利多科技（中國(guó)）有限公司；離心機(jī)：Centrifuge 5810R，艾本德中國(guó)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 牛磺酸含量的測(cè)定

根據(jù)GB 5009.169—2016的第二法丹磺酰氯柱前衍生法對(duì)乳粉樣品進(jìn)行測(cè)定。

1.2.2 數(shù)學(xué)模型的建立

試樣中牛磺酸的含量按下式進(jìn)行計(jì)算[13]。

式中：X為牛磺酸的檢測(cè)結(jié)果，mg/100 g；c為上機(jī)液中牛磺酸的濃度，μg·mL-1；V為實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的定容體積，mL；m為取樣量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)量不確定度來(lái)源分析

根據(jù)GB 5009.169—2016的第二法，分析了牛磺酸檢測(cè)的基本流程。在建立了1.2.2的數(shù)學(xué)模型之后，通過(guò)分析數(shù)學(xué)模型中的各個(gè)參數(shù)，列出每個(gè)參數(shù)的不確定度來(lái)源。不確定度的主要來(lái)源分析見(jiàn)圖1，主要由如下3個(gè)因素構(gòu)成。①樣品的重復(fù)性檢測(cè)（每個(gè)參數(shù)的重復(fù)性可合并統(tǒng)一計(jì)算）。②由標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入，其中涉及標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)本身的純度、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的稱量定容和稀釋、校準(zhǔn)曲線的配制和線性擬合。③由前處理過(guò)程中帶入，需要考慮設(shè)備的性能、穩(wěn)定性、檢測(cè)環(huán)境因素等方面，包含了用于稱量試樣的電子天平、用于試樣定容的容量瓶的不確定度，以及回收率檢測(cè)結(jié)果引入的不確定度。

圖1 測(cè)量不確定度的來(lái)源分析圖

2.2 各分量的不確定度評(píng)定

2.2.1 試樣的重復(fù)測(cè)定結(jié)果引入的不確定度urel(rep)

對(duì)試樣進(jìn)行10次的獨(dú)立重復(fù)性檢測(cè)，所得結(jié)果見(jiàn)表1。由于試樣的檢測(cè)過(guò)程能覆蓋整個(gè)方法的全過(guò)程，而且還能同時(shí)體現(xiàn)出稱量、定容等分量的重復(fù)性，因此可以采用A類評(píng)定的方法，統(tǒng)一對(duì)重復(fù)性的不確定度進(jìn)行計(jì)算。

表1 牛磺酸的測(cè)定值表

10次獨(dú)立測(cè)量結(jié)果的平均值xˉ=39.4 mg/100 g。根據(jù)格拉布斯檢驗(yàn)法，下側(cè)上側(cè)在檢出水平a=0.05時(shí)臨界值G1-0.05/2(10)=2.290，G＜G'＜G0.975(10)，沒(méi)有離群值。

多次（n=10）重復(fù)測(cè)定，計(jì)算得出標(biāo)準(zhǔn)偏差為日常檢測(cè)對(duì)被測(cè)樣品實(shí)際測(cè)量時(shí)，重復(fù)測(cè)量2次，即n'=2，因?yàn)閮x器比較穩(wěn)定、測(cè)量過(guò)程可控，因此重復(fù)性導(dǎo)致的A類標(biāo)準(zhǔn)不確定度為相對(duì)不確定度分量為

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的配制過(guò)程引入的不確定度urel(ρ)

由標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的配制過(guò)程引入的不確定度主要來(lái)自標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)本身的純度，還有標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的稱量和定容過(guò)程。

稱量過(guò)程使用電子天平，其不確定度主要來(lái)自于電子天平本身的偏載誤差、示值誤差和重復(fù)性。重復(fù)性已在之前樣品的測(cè)量結(jié)果重復(fù)性中考慮，因此不再重復(fù)計(jì)算。根據(jù)《電子天平檢定規(guī)程》（JJG 1036—2008），I級(jí)天平的偏載誤差要求在±1.0e之內(nèi)，示值誤差要求在±0.5e之內(nèi)[14]。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中使用天平的檢定證書(shū)顯示檢定結(jié)果合格。因此，由天平產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量使用B類評(píng)定。電子天平假設(shè)服從均勻分布，e=0.1 mg，偏載誤差的區(qū)間半寬度am1=0.1 mg，由此引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為示值誤差的區(qū)間半寬度am2=0.05 mg，由此引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為稱量過(guò)程的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度可合成為

牛磺酸實(shí)際稱量的質(zhì)量為m=25.08 mg，這是通過(guò)2次測(cè)量相減得出的，所以相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

標(biāo)準(zhǔn)品定容時(shí)使用25 mL容量瓶，定容過(guò)程會(huì)存在的不確定度主要有容量瓶本身的允差、實(shí)驗(yàn)室環(huán)境溫度的變化和重復(fù)性[15]。按照《常用玻璃量器檢定規(guī)程》（JJG 109—2006），A級(jí)容量瓶最大容量允差為±0.03 mL，容量瓶假設(shè)服從三角分布，引入的不確定度分量為X=（39.4±2.1）mg/100 g。容量瓶校準(zhǔn)溫度為20 ℃，實(shí)驗(yàn)室室內(nèi)溫度在±4 ℃變動(dòng)。環(huán)境溫度變動(dòng)對(duì)體積的影響可以通過(guò)體積膨脹系數(shù)來(lái)計(jì)算。水的體積膨脹系數(shù)為2.1×10-4℃-1，對(duì)體積測(cè)量所引入的不確定度分量為

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書(shū)中提供的數(shù)據(jù)，牛磺酸純度是99.9%，U=±0.6%（k=2），因此不確定度U=0.6%/2=0.3%，由純度引入的不確定度計(jì)算公式為

將3個(gè)分量合成，得到標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的不確定度分量為

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配制校準(zhǔn)曲線過(guò)程所引入的不確定度urel(s)

校準(zhǔn)曲線的配制步驟中會(huì)用到不同規(guī)格的移液管和容量瓶，移液管和容量瓶的允差及實(shí)驗(yàn)室環(huán)境溫度引起的體積變化會(huì)引入不確定度分量。

校準(zhǔn)曲線的配制過(guò)程如下：分別使用0.25 mL、1.00 mL、5.00 mL和10.00 mL的吸量管移取0.25 mL、1.00 mL、2.50 mL、5.00 mL和10.00 mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于5個(gè)50 mL容量瓶中，得到牛磺酸工作曲線的濃度分別為0.5 μg·mL-1、2.0 μg·mL-1、5.0 μg·mL-1、10.0 μg·mL-1和20.0 μg·mL-1。依據(jù)JJG 196—2006中的玻璃容器允差要求，吸量管假設(shè)為均勻分布計(jì)算，容量瓶假設(shè)為三角分布計(jì)算，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 校準(zhǔn)曲線配制過(guò)程的不確定度評(píng)定表

由此得到校準(zhǔn)曲線在配制過(guò)程引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.2.4 最小二乘法擬合校準(zhǔn)曲線引入的不確定度urel(c)

通過(guò)最小二乘法得到的校準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品溶液中牛磺酸的含量。用標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制出濃度依次為0 μg·mL-1、0.50 μg·mL-1、2.00 μg·mL-1、5.00 μg·mL-1、10.00 μg·mL-1和20.00 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)工作點(diǎn)，通過(guò)最小二乘法擬合校準(zhǔn)曲線時(shí)，計(jì)算得到的濃度c0的不確定度僅與峰面積的測(cè)量不確定度有關(guān)。對(duì)不同含量的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液各測(cè)量2次，共計(jì)12次，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 不同濃度牛磺酸校準(zhǔn)溶液的峰面積響應(yīng)值表

擬合校準(zhǔn)曲線的方程為A=B1c+B0=11.91c-0.379 2。校準(zhǔn)曲線擬合直線的殘差標(biāo)準(zhǔn)偏差為

對(duì)被測(cè)樣品測(cè)量2次，即p=2，測(cè)得樣品溶液的牛磺酸濃度為c0=7.987 μg·mL-1，其標(biāo)準(zhǔn)不確定度及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.2.5 樣品前處理過(guò)程

由樣品前處理過(guò)程引入的不確定度主要來(lái)自試樣的稱量過(guò)程urel(m)、定容過(guò)程urel(V)和回收率urel(r)。

（1）稱量用電子天平的不確定度主要來(lái)自電子天平本身的偏載誤差、示值誤差和重復(fù)性。重復(fù)性已在之前的樣品測(cè)量結(jié)果重復(fù)性中考慮，因此不再重復(fù)計(jì)算。根據(jù)JJG 1036—2008，I級(jí)天平的偏載誤差要求在±1.0e之內(nèi)，示值誤差要求在±0.5e之內(nèi)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中使用天平的檢定證書(shū)顯示，天平偏載誤差為-0.1 mg，示值誤差為0.0 mg，檢定合格。采用B類評(píng)定，電子天平一般假設(shè)服從均勻分布，e=1.0 mg，偏載誤差的區(qū)間半寬度am1=1.0 mg，標(biāo)準(zhǔn)不確定度為示值誤差的區(qū)間半寬度am2=0.5 mg，標(biāo)準(zhǔn)不確定度為SR。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱量的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度試樣質(zhì)量m=2.038 1 g是通過(guò)兩次稱量相減得出的，所以試樣稱重過(guò)程的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

（2）樣品定容時(shí)使用100 mL容量瓶，定容的不確定度主要來(lái)自容量瓶允差、溫度變動(dòng)以及重復(fù)性[15]。根據(jù)JJG 109—2006，A級(jí)容量瓶容量允差為±0.1 mL，假設(shè)服從三角分布，不確定度分量為容量瓶校準(zhǔn)溫度是20 ℃，實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境溫度控制在±4 ℃。水的體積膨脹系數(shù)為2.1×10-4℃-1，體積測(cè)量所引入的不確定度分 量 為將兩分量合成，得出定容的不確定度分量為相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

（3）回收率結(jié)果如表4所示。對(duì)回收率的數(shù)據(jù)進(jìn)行檢驗(yàn)，理論上理想的回收率應(yīng)為100%，因此可通過(guò)t檢驗(yàn)法對(duì)實(shí)測(cè)回收率與理論回收率的差異進(jìn)行顯著性分析。根據(jù)公式計(jì)算統(tǒng)計(jì)量t，在95%的置信水平下，顯著水平a=0.05，自由度為f=n-1=5（n=6），查雙尾t分布表得到臨界值ta(f)為2.571。t＞ta(f)，因此實(shí)測(cè)回收率與理論回收率有顯著性差異，需要通過(guò)回收率校正檢測(cè)結(jié)果。由回收率的結(jié)果引入的不確定度為相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

表4 牛磺酸加標(biāo)回收率表

2.3 合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度的匯總

將以上的不確定度分量進(jìn)行整理匯總，并列出各種分量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度數(shù)據(jù)，結(jié)果如表5所示。

表5 牛磺酸測(cè)量不確定度匯總表

從表5可以發(fā)現(xiàn)，7種不確定度分量對(duì)合成不確定度的貢獻(xiàn)程度有很大的不同，由大到小依次為urel(rep)＞urel(s)＞urel(r)＞urel(ρ)＞urel(c)＞urel(V)＞urel(m)，其中樣品的測(cè)量結(jié)果重復(fù)性u(píng)rel(rep)、標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制過(guò)程urel(s)的貢獻(xiàn)程度較大。

根據(jù)表5，牛磺酸含量測(cè)定的合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.4 結(jié)果的表達(dá)

3 結(jié)論

依據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.169—2016的第二法測(cè)定奶粉中營(yíng)養(yǎng)成分牛磺酸的含量，然后對(duì)測(cè)定結(jié)果的不確定度進(jìn)行評(píng)定。當(dāng)樣品中牛磺酸的含量為39.4 mg/100 g時(shí)，擴(kuò)展不確定度U=2.1 mg/100 g（k=2）。測(cè)定結(jié)果的不確定度分量中，7種不確定分量對(duì)合成不確定度的貢獻(xiàn)具有很大的差別，從大到小依次為urel(rep)＞urel(s)＞urel(r)＞urel(ρ)＞urel(c)＞urel(V)＞urel(m)。其中樣品的測(cè)量結(jié)果重復(fù)性u(píng)rel(rep)、校準(zhǔn)溶液的配制過(guò)程urel(s)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度數(shù)值較大，因此這兩項(xiàng)引入的不確定度占比高，是本實(shí)驗(yàn)牛磺酸結(jié)果的合成不確定度的主要貢獻(xiàn)因子。可見(jiàn)采用柱前衍生-高效液相色譜法測(cè)定牛磺酸含量時(shí)，重復(fù)性和校準(zhǔn)溶液配制過(guò)程是測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確與否的關(guān)鍵。

在實(shí)際檢測(cè)分析中，可以通過(guò)加強(qiáng)培訓(xùn)、提高檢測(cè)人員的熟練程度來(lái)減少重復(fù)性測(cè)量引入的不確定度；同時(shí)可采取使用精度高的量器、簡(jiǎn)化校準(zhǔn)溶液的配制步驟、增加校準(zhǔn)溶液的測(cè)定次數(shù)等措施，規(guī)避或減少由這些步驟引入的不確定度，從而提高結(jié)果的準(zhǔn)確性。得到方法的相對(duì)不確定度后，可以使用不確定度的結(jié)果來(lái)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量控制。