超高效液相色譜-串聯質譜法同時測定雞肉、雞蛋中尼卡巴嗪、金剛烷胺、金剛乙胺殘留量

◎ 歐陽思雨，藍 偉，賈 佳，胡秋連，杜裕芳

（江西省檢驗檢測認證總院食品檢驗檢測研究院，江西 南昌 330000）

尼卡巴嗪（Nicarbazin）是一種廣譜、穩定、高效的抗球蟲藥物，因此用作飼料添加劑預防雞球蟲病是非常廣泛的，然而尼卡巴嗪殘留物代謝緩慢[1]，易通過食物鏈對人體健康產生潛在威脅。金剛烷胺（Amantadine）和金剛乙胺（Rimantadine）作為一類抗流感病毒藥物，也易被非法用于畜禽養殖業，若被非法濫用則易導致個體產生抗藥性甚至導致病毒產生變異，同樣會對人們產生危害。而雞肉和雞蛋是人類日常生活中主要食物來源之一，目前液質通常是按照食品安全國家標準分開檢測尼卡巴嗪和金剛烷胺、金剛乙胺，作為常檢項目，本文旨在建立一種同時檢測雞肉和雞蛋中尼卡巴嗪、金剛烷胺和金剛乙胺的方法，既可以實現對雞肉和雞蛋類食品進行大批量、快速高效的定性和定量分析測定，也能滿足市場需求，對藥物殘留問題起到日常監管作用。

1 材料與方法

1.1 試劑耗材

鹽酸金剛烷胺，Dr.Ehrenstorfer GmbH，99.4%；鹽酸金剛乙胺，Standard Chemicals，99.2%；尼卡巴嗪，BePure，99.7%；金剛烷胺-D15，BePure，99.2%；美金剛-D6，CATO，98.0%；尼卡巴嗪-D8，WITEGA，99.9%；甲醇、乙腈、二甲基甲酰胺、正己烷、甲酸，均為色譜純；冰乙酸、無水硫酸鈉，分析純；PSA凈化吸附劑（乙二胺-N-丙基硅烷），粒度40 μm；濾膜，0.22 μm。市售雞肉和雞蛋。

1.2 儀器設備

沃特世TQS液質聯用儀，美國沃特世公司；SL8臺式離心機，美國Thermo Fisher Scientific公司；Vortex Wizard渦旋儀；N-EVAP氮吹儀，美國-Organomation公司；QUINTIX213-1CN電子天平，上海-賽多利斯公司。

1.3 標準品及標準溶液配制

分別精密稱取標準物質和內標物質適量，置于6只10 mL容量瓶中，金剛烷胺、金剛乙胺、金剛烷胺-D15和美金剛-D6用甲醇定容，尼卡巴嗪和尼卡巴嗪-D8用二甲基甲酰胺定容。將上述標準儲備液，用甲醇稀釋得到金剛烷胺、金剛乙胺、尼卡巴嗪的混合標準使用液和金剛烷胺-D15、美金剛-D6、尼卡巴嗪-D8的混合內標使用液。

分別吸取上述混合標準使用液，用50%乙腈定容，得到混合外標濃度均為1 ng·mL-1、2 ng·mL-1、5 ng·mL-1、10 ng·mL-1、20 ng·mL-1、50 ng·mL-1和100 ng·mL-1，內標金剛烷胺-D15、金剛乙胺-D6、尼卡巴嗪-D8濃度為20 ng·mL-1、10 ng·mL-1、50 ng·mL-1的標準系列工作液。

1.4 樣品處理

稱取均質后的樣品2 g于50 mL離心管中，加入混合內標使用液10 μL，加1%乙酸乙腈溶液10 mL，渦旋2 min，4 500 r·min-1離心5 min，上清液轉移至另一離心管中，重復提取1次，合并兩次上清液，加無水硫酸鈉3 g，正己烷10 mL，渦旋1 min，4 500 r·min-1離心3 min，棄去正己烷層，剩余溶液轉移至離心管中，40 ℃氮吹至近干，用1.0 mL甲醇溶解殘渣，加入PSA 50 mg，渦旋30 s，離心，吸取上清液0.5 mL 40 ℃氮氣吹干，加入50%乙腈水溶液0.5 mL，渦旋30 s，溶液過0.22 μm濾膜待測。

1.5 儀器分析條件

1.5.1 色譜條件

色譜柱：Eclipse Plus C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流速：0.25 mL·min-1；柱溫：40 ℃；進樣量：1 μL；優化后的流動相洗脫梯度見表1。

表1 梯度洗脫程序表

1.5.2 質譜條件

離子源：電噴霧離子源；掃描方式：金剛烷胺和金剛乙胺為正離子掃描，尼卡巴嗪為負離子掃描；檢測方式：多反應離子檢測；毛細管電壓：ESI+2.75 kV，ESI-2.46 kV；脫溶劑氣溫度：450 ℃；脫溶劑氣流量：800 L·h-1；錐孔反吹氣流量：150 L·h-1。優化后的相關參數見表2。

2 結果與分析

2.1 前處理方法的優化

金剛烷胺、金剛乙胺結構中均含有氨基且極性較強[2]，而尼卡巴嗪使用乙腈提取效率較好[3]，分別選用純乙腈、1%乙酸乙腈、5%乙酸乙腈作為提取溶劑，考察不同提取溶劑對3種化合物的提取效果，結果表明1%乙酸乙腈對金剛烷胺和金剛乙胺的提取效果優于純乙腈，對尼卡巴嗪的提取效果優于5%乙酸乙腈，因此選擇1%乙酸乙腈作為提取溶劑，既能提高金剛烷胺和金剛乙胺的提取效果，又能保證尼卡巴嗪的提取效果。無水硫酸鈉能使水飽和，將目標物充分萃取到乙腈層，而選擇有機溶劑之后再加入鹽，可以避免樣品局部過熱導致的回收率降低。PSA主要用于去除樣品中的有機酸和糖類等物質，減少樣品基質中的干擾[4]。

表2 質譜參數表

2.2 儀器條件優化

金剛烷胺和金剛乙胺分子結構中的氨基在離子化過程中易得到H+形成穩定的[M+H]+離子，因此采用電噴霧正離子（ESI+）掃描模式；尼卡巴嗪容易丟失H+以形成穩定的[M-H]-離子，因此采用電噴霧負離子（ESI-）掃描模式。在MS定量分析時，采用金剛烷胺-D15作為金剛烷胺的內標物質，美金剛-D6作為金剛乙胺的內標物質，尼卡巴嗪-D8作為尼卡巴嗪的內標物質，來進行定量分析，以用于控制樣品提取凈化、分離和電離等過程中的誤差。流動相則選擇使用基線更平穩、得到更好峰形的乙腈和可以增加金剛烷胺、金剛乙胺的電離效果以及對尼卡巴嗪影響不太大的0.1%甲酸水，來進行洗脫分離，3種組分都能達到較好的峰形和分離度，見圖1。

圖1 各組分離子對質譜圖

2.3 方法學驗證

2.3.1 標準曲線及靈敏度

以目標物的濃度與相應的峰面積建立曲線，權重1/x，計算信噪比，以S/N≥10確定定量限。各物質信噪比見表3。

表3 各組分上機濃度及信噪比表

2.3.2 基質效應

基質效應計算公式為

式中：A為基質標準點的峰面積；B為溶劑標準點的峰面積；|ME|≤20%，可認為該基質沒有基質效應[5]。

不加內標溶液參照1.4樣品處理得到樣品的基質溶液，用基質溶液配制標準點，上機測定，得到基質標準點的峰面積，與溶劑標準點峰面積比較，計算尼卡巴嗪、金剛烷胺、金剛乙胺的|ME|值分別為11.39%、4.19%、5.15%，均小于20%，可以判斷，尼卡巴嗪、金剛烷胺和金剛乙胺在雞肉和雞蛋中基本無基質效應。

2.3.3 回收率和精密度

分別在陰性樣品中添加0.5 μg·kg-1、1.0 μg·kg-1、5.0 μg·kg-1共3個濃度水平的3種物質混合標準使用液，每個水平做6平行，按照1.4樣品處理方法進行處理測定，結果見表4，本方法回收率為80.4%～112.3%，相對標準偏差為3.4%～7.3%，能滿足尼卡巴嗪、金剛烷胺和金剛乙胺的檢測要求。

表4 三梯度六平行加標回收率表

2.3.4 實際樣品檢測

采用上述方法隨機檢測了市場上60批雞肉樣品和20批雞蛋樣品，其中一份雞肉樣品中檢出尼卡巴嗪含量為61 μg·kg-1，其余樣品均未檢出上述3種成分殘留。

3 結論

本實驗建立了一種超高效液相色譜串聯質譜同時測定雞肉、雞蛋中尼卡巴嗪、金剛烷胺、金剛乙胺殘留量的檢測方法。優化了色譜條件、質譜條件，采用內標校正，定量限低，靈敏度高，準確度好，回收率好，能夠同時進行雞肉、雞蛋中尼卡巴嗪、金剛烷胺和金剛乙胺的定量測定，可節省部分成本，大批量快速篩查雞肉和雞蛋中的這3種成分，能夠更加快捷地完成檢驗檢測機構日常樣品的檢測需要，可用于實際測定。