高效液相色譜法測定熏、烤水產品中苯并[a]芘的不確定度評定

◎ 石劍夫，焦文佳，陳 茹

（1.廣東省食品工業公共實驗室，廣東 廣州 511442；2.廣東省食品工業研究所有限公司，廣東 廣州 511442；3.廣東省食品質量監督檢驗站，廣東 廣州 511442）

苯并[a]芘是苯與芘稠合而成的一類多環芳烴，具有明顯致癌作用[1-2]。目前研究發現，食品中的苯并[a]芘的來源有兩種：由工業生產、煤炭的不完全燃燒產生，通過空氣、水流和土壤進入糧食、蔬菜瓜果、水產和動物制品中；高溫烘烤、油炸、煙熏、烹調時，食品中的碳水化合物、蛋白質等有機物發生裂解反應，再經過一系列化學反應形成苯并[a]芘。GB 2762—2017[3]規定，熏、烤水產品中苯并[a]芘的安全限量為5.0 μg·kg-1。因此，準確測定熏、烤水產品中苯并[a]芘的含量非常重要。

不確定度評定是一種評價檢測方法科學性、合理性的常用方式，可以為測試結果的準確性提供參考。此次熏、烤水產品中苯并[a]芘的檢測按照國家標準GB 5009.27—2016[4]開展，并建立不確定度來源分析數學模型，以評定檢驗過程中產生的不確定度[6-8]。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

H-class plus超高效液相色譜儀（Waters）；ME204E/02電子天平，萬分之一，梅特勒-托利多（上海）有限公司。苯并[a]芘（100.0%），CAS:50-32-8（AccuStandard）；甲醇（LC-MS，Merck）；乙腈（LC-MS，Merck）；試驗用水均為一級水。

1.2 提取樣液

嚴格按照標準GB 5009.27—2016[4]進行試樣制備、提取和凈化。將柴魚花片試樣經過制樣、稱樣、正己烷提取、苯并[a]芘分子印跡柱過柱、復溶和過膜等標準化步驟獲得樣液[4]。

1.3 標準曲線的繪制

用移液器將苯并[a]芘標物轉移至儲備液瓶中，得苯并[a]芘儲備液（100.4 μg·mL-1）。用移液器吸取苯并[a]芘儲備液20 μL于10 mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，得苯并[a]芘中間液200.8 ng·mL-1，當天配制。分別移取中間液0.025 mL、0.050 mL、0.250 mL、0.500 mL、1.000 mL于10 mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，得標準曲線系列溶液。

1.4 色譜條件

色譜柱：C18柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流動相：乙腈+水=（88+12）；流速：0.4 mL·min-1；柱溫：35 ℃；檢測波長：激發波長384 nm，發射波長406 nm。

2 數學模型

食品中苯并[a]芘的含量測定采用標準曲線法定量，定量結果按下面的公式計算。

式中：X為試樣中苯并[a]芘的含量，μg·kg-1；V為樣液最終定容體積，mL；Cx為標準曲線上對應的苯并[a]芘的質量濃度，ng·mL-1；m為試樣質量，g；F為濃縮倍數；1 000為ng·g-1換算成μg·kg-1的換算因子。

3 不確定度來源分析

通過分析苯并[a]芘含量的計算公式，食品中苯并[a]芘檢驗的不確定度來源主要有樣品質量、前處理過程、標準溶液、標準曲線擬合及測量重復性等。詳情見圖1。

圖1 不確定度來源分析圖

4 不確定度分析

4.1 由苯并[a]芘標準曲線引入的不確定度分量urel,1

4.1.1 由苯并[a]芘標準物質引入的不確定度分量urel,2

通過查詢所使用的苯并[a]芘標準品的標準物質證書，其擴展不確定度為2.4%，取置信水平p=95%，包含因子k=2，則可得其相對標準不確定度為

4.1.2 使用器具進行標準曲線配制而引入的不確定度urel,3

使用容量瓶定容和使用移液器移取溶液是標準曲線配置的主要不確定度來源。本實驗所使用的容量瓶均通過檢定，符合標準要求。依據《常用玻璃量器檢定規程》（JJG 196—2006）和移液器的校準證書，按照三角分布計算，使用容量瓶定容和使用移液器移取溶液引入的不確定度見表1。本實驗在標準曲線配置過程中引入的不確定度為

表1 使用容量瓶和移液器引入的不確定度表

4.1.3 環境溫度變化引入的不確定度urel,4

本實驗在（20±4）℃條件下進行，經查，乙腈的膨脹系數為1.37×10-3℃-1，按照矩形分布計算，在配制標準曲線時由于環境溫度變化而引入的不確定度見表2。

表2 環境溫度變化引入的不確定度表

環境溫度變化引入的合成相對標準不確定度為

由苯并[a]芘標準曲線引入的合成相對標準不確定度分量為

4.2 標準曲線擬合及結果重復性引入的相對標準不確定度urel,5

4.2.1 結果重復性引入的不確定度分量urel,6

在相同條件下，按照標準檢驗方法對同一試樣重復檢驗6次，檢驗結果分別為21.4 μg·kg-1、21.3 μg·kg-1、21.1 μg·kg-1、21.5 μg·kg-1、21.5 μg·kg-1和21.5 μg·kg-1，則重復性不確定度分量為

重復性相對標準不確定度分量為

4.2.2 標準曲線擬合引入的相對標準不確定度urel,7

使用高效液相色譜儀將苯并[a]芘標準曲線系列溶液測定3次，分別得到苯并[a]芘標準曲線系列溶液各濃度各3個峰面積，分別取平均值，以苯并[a]芘標準曲線系列溶液的濃度為橫坐標（x），峰面積為縱坐標（y），求其回歸方程和相關參數，詳情見表3。

表3 苯并[a]芘標準曲線系列溶液3次測定的結果表

計算得到苯并[a]芘標準曲線的線性回歸方程為y=60 421x+2 900.7，相關系數r=1，由此可知，苯并[a]芘濃度和峰面積具有顯著的線性相關性。

回歸直線的標準偏差（y殘差的標準差）計算為

式中：m為每個測量點重復測量次數，m=3；n為測量點數，n=5；yij為儀器各點響應值；yi為回歸直線計算值。

由苯并[a]芘的峰面積引入的不確定度分量u1為

回歸系數斜率的不確定度u2為

回歸系數截距的不確定度u3為

不確定度分量u1～u3符合應用公式（3）。

先計算器傳播系數，對線性方程y=ax+b求偏導知：

其相對標準不確定度分量為

由結果重復性和標準曲線擬合引入的合成相對標準不確定度分量為

4.3 試樣前處理過程中引入的相對標準不確定度urel,8(Q)

4.3.1 稱量試樣引入的相對標準不確定度urel,9(m)

使用萬分之一天平稱取6份試樣，其質量分別為1.002 4 g、1.002 6 g、1.001 7 g、1.003 9 g、1.006 7 g和1.005 8 g，計算得方差為0.000 003 37。經查，試樣稱量所使用的萬分之一天平，其最大允差為0.50 mg，按矩形分布稱量試樣引入的標準不確定度為

稱量試樣引入的相對標準不確定度為

4.3.2 試樣前處理過程中所用器量引入不確定度urel,10(V3)

取5 mL正己烷（定容體積）時用5 mL移液器，其最大允許誤差為±30.00 μL，依據三角分布

最終定容體積時用1 000 μL移液器，其最大允許誤差為±10.00 μL，依據三角分布移取1 mL乙腈時引入的相對不確定度為

取0.5 mL復溶液于1 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度線時。使用的1 000 μL移液器最大允許誤差為±5.00 μL，依據三角分布移取1 mL乙腈時引入的相對不確定度為

使用的1 mL容量瓶最大允許誤差為±0.010 mL，依據三角分布其相對不確定度為

相對標準不確定度為

4.3.3 溫度不同引入的標準不確定度分量urel,15(T3)

實驗在（20±4）℃條件下進行，經查，正己烷的膨脹系數為1.36×10-3℃-1，乙腈的膨脹系數為1.37×10-3℃-1，檢定標準溫度（20 ℃）和溶液溫度不同引入的不確定度分量urel,15(T3)，按照矩形分布計算。

4.3.4 樣品處理過程中引入的相對標準不確定度urel,8(Q)用5 mL移取兩次引入的不確定度為

4.4 合成相對標準不確定度的評定

經過本實驗可得食品中苯并[a]芘測定的各主要不確定度分量（表4），計算可得總合成相對擴展不確定為

表4 食品中苯并[a]芘測定的合成相對擴展不確定的分量表

4.5 評定本次檢驗的相對擴展不確定度

本次檢驗的相對擴展不確定度公式為Urel=k×urel，假設本次檢驗過程誤差符合正態分布，取置信水平p=95%，包含因子k=2，則本次檢驗的相對擴展不確定度為Urel=2×0.037×100%=7.4%。

苯并[a]芘相對擴展不確定度為7.4%，樣品檢出21.3 μg·kg-1，則其擴展不確定度為U=21.3×7.4%=1.6 μg·kg-1。

5 結論

本次采用高效液相色譜法檢驗熏、烤水產品中的苯并[a]芘含量，經過分析過程和計算不確定度，可知配制苯并[a]芘標準溶液引入的不確定度最大，建議從事該方法檢驗的檢驗人員在標準溶液配制過程中應盡可能地選擇高精度的器具，定期對相關器具和儀器進行檢定或校準，保證器具和儀器處于正常工作狀態。同時，檢驗人員也應按照標準要求規范操作，通過培訓學習提高檢驗人員專業技能，減少人工誤差，從而保證檢驗結果準確可靠。