Captiva EMR-Lipid小柱凈化-超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法快速測定雞肉中12種獸藥殘留

◎ 許均圖，陳德斌，陳 燕，唐春玲

（廣州華鑫檢測技術(shù)有限公司，廣東 廣州 510663）

雞肉含有豐富的蛋白質(zhì)和維生素等營養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)脂肪和膽固醇含量較低，是人們?nèi)粘Ｉ钪兄匾氖称贰Ｓ捎谵r(nóng)戶在養(yǎng)殖過程中不合理使用和濫用獸藥，并在飼料中違規(guī)添加獸藥或不遵守休藥期等原因，使雞肉產(chǎn)品中獸藥殘留超標(biāo)問題屢見報(bào)道。雞肉的質(zhì)量安全越來越成為人們關(guān)注的問題[1]。我國現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了許多類獸藥殘留的檢測方法，但是這些方法很多都是針對同一類獸藥殘留，而且前處理方法較為煩瑣，靈敏度較低。因此有必要建立一種檢出限低且簡單快速同時(shí)檢測雞肉中多類別獸藥殘留的方法[2-3]。

高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法是一種兼具高效分離和定性定量的新型分析方法，具有高特異性和高靈敏度，被廣泛應(yīng)用于獸藥殘留、農(nóng)藥殘留和毒素的分析檢測[4-5]。本研究選取日常檢測中常見的磺胺類、喹諾酮類、氯霉素類和五氯酚等獸藥殘留作為研究對象，通過優(yōu)化前處理方法和色譜條件，結(jié)合Captiva EMRLipid脂質(zhì)凈化技術(shù)，建立了快速同時(shí)測定雞肉中磺胺類、喹諾酮類、氯霉素類和五氯酚等12種獸藥殘留的超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試劑

甲醇、乙腈、甲酸均為色譜純，MREDA公司；超純水，MILLIPORE超純水機(jī)制備；其他試劑均為分析純。

1.1.2 標(biāo)準(zhǔn)品

磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺喹噁啉、諾氟沙星、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、氯霉素、氟苯尼考和五氯酚，均購自安譜公司。上述標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇溶解，配制成100 μg·mL-1的儲(chǔ)備液，保存于-20 ℃冰箱中。用乙腈配制混合標(biāo)準(zhǔn)使用液，其中磺胺類、喹諾酮類濃度為1.0 μg·mL-1，氯霉素類、五氯酚濃度為100 ng·mL-1。

1.1.3 儀器

超高效液相色譜串聯(lián)三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（Waters UPLC，Waters公司；TSQ Quantum，賽默飛公司）；超聲波儀（昆山市超聲儀器有限公司）；多管渦旋振蕩器（安譜公司）；氮吹儀（北京八方世紀(jì)）；高速冷凍離心機(jī)（湖南赫西）；Captiva EMR-Lipid固相萃取柱（600 mg/6 mL，安捷倫公司）。

1.2 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取（2.00±0.01）g均質(zhì)好的雞肉樣品，加入1 mL超純水，渦旋分散后，準(zhǔn)確加入10 mL 2%甲酸乙腈溶液振蕩5 min，超聲5 min，再加入5 g無水MgSO4、1 g NaCl振蕩1 min，4 ℃下10 000 r·min-1離心5 min。準(zhǔn)確移取5 mL上層乙腈溶液至15 mL離心管中，加入1 mL超純水，混勻后過Captiva EMRLipid小柱，加入1 mL 80%乙腈淋洗，擠干并收集所有流出液于5 mL離心管中，50 ℃下氮吹濃縮至0.5 mL，用純水定容至1.0 mL，混勻后過0.22 μm PTFE濾膜，待上機(jī)分析。

1.3 色譜質(zhì)譜條件

色 譜 柱 為Agilent Eclipse Plus C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm），柱溫35 ℃。正離子模式下和五氯酚的流動(dòng)相為0.1%甲酸溶液含5 mmol·L-1甲酸銨-（A）和甲醇（B），流速0.2 mL·min-1。梯度洗脫程序：0～1 min，10% B；1～5 min，10%～95% B；5～7 min，95% B；7.1～10 min，10% B。負(fù)離子模式下流動(dòng)相為甲醇∶水=6+4，流速0.2 mL·min-1。進(jìn)樣量：2 μL。

電噴霧離子源；鞘氣：35 aux，輔助氣：15 aux，毛細(xì)管溫度：350 ℃；電噴霧電壓：正離子4 500 V、負(fù)離子3 500 V；掃描模式：選擇反應(yīng)監(jiān)測（SRM）；各個(gè)化合物經(jīng)優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 獸藥殘留的質(zhì)譜檢測參數(shù)表

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理?xiàng)l件優(yōu)化

2.1.1 提取溶劑的選擇

比較了乙腈和甲酸濃度為1%、2%和5%的酸化乙腈作為提取溶劑的提取效率，結(jié)果表明甲酸的加入有助于提高磺胺類、喹諾酮類和五氯酚藥物的回收率，其中2%甲酸乙腈的總體回收率最好，因此選擇甲酸濃度為2%的酸化乙腈作為提取溶劑。由于酸化乙腈會(huì)使樣品結(jié)塊，不利于提取，因此在提取前加入1 mL水分散樣品，并加入無水MgSO4和NaCl，通過鹽析作用減少水溶性雜質(zhì)的溶出，提高了提取效率。

2.1.2 凈化方法的選擇

雞肉中含有豐富的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)，如果不經(jīng)過凈化直接上樣分析，很容易污染離子源，同時(shí)較強(qiáng)的基質(zhì)效應(yīng)也會(huì)降低待分析物的響應(yīng)，使得定量結(jié)果偏低，因此應(yīng)選擇適當(dāng)?shù)膬艋绞健１狙芯窟x擇安捷倫Captiva EMR-Lipid小柱作為凈化手段。EMR小柱無需活化、能凈化樣品蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等干擾物，操作簡單。

2.2 方法學(xué)確認(rèn)

2.2.1 線性范圍和檢出限

采用空白雞肉樣品處理后，加入標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成濃度為0.1～100.0 ng·mL-1的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，上機(jī)測定。12種獸藥殘留的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.995。以信噪比法計(jì)算各獸藥殘留的方法檢出限，12種獸藥殘留的檢出限見表2。

2.2.2 方法的回收率

采用無上述獸藥殘留檢出的空白雞肉樣品加標(biāo)，按上述前處理方法進(jìn)行處理，計(jì)算回收率，如表2所示。12種獸藥殘留的檢出限為0.1～2.0 μg·kg-1，回收率為68.1%～105.9%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.9%～11.9%。

表2 檢出限、加標(biāo)回收率和精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果表（n=6）

2.3 實(shí)際樣品檢出

應(yīng)用建立的方法對市售的雞肉樣品進(jìn)行檢測，共檢出陽性樣品2批，其中恩諾沙星1批1 089 μg·kg-1；五氯酚1批22.0 μg·kg-1。將陽性樣品用國家標(biāo)準(zhǔn)方法復(fù)測驗(yàn)證，結(jié)果與本研究方法吻合，說明了本研究方法的準(zhǔn)確性。陽性樣品的SRM譜圖見圖1。

圖1 陽性樣品的SRM譜圖

3 結(jié)論

本研究建立了使用Captiva EMR-Lipid脂質(zhì)凈化技術(shù)，結(jié)合超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法快速測定雞肉中磺胺類、喹諾酮類、氯霉素類和五氯酚等12種獸藥殘留的分析方法，并應(yīng)用于實(shí)際樣品的檢測。結(jié)果表明該方法操作簡單、回收率和精密度較好、靈敏度高，適合應(yīng)用于雞肉中獸藥殘留的快速篩查。