高效液相色譜法同時測定食品中7種防腐劑的研究

◎ 付志明，黃小芳，劉賢標，李枝明

（贛州市綜合檢驗檢測院，江西 贛州 341000）

隨著食品工業的快速發展，各種各樣的添加劑得到了研發和使用，在保證食品能夠維持原本的營養價值和品質方面起了很大作用。但防腐劑多為人工合成物質，部分帶有微量毒素，若過量添加在食品中則會給人體健康帶來危害。檢測防腐劑的方法較多，包含離子色譜法、氣相色譜法、液相色譜-串聯質譜法等[1]。但食品中包含許多復雜成分，導致防腐劑的檢測容易受到基質干擾，導致結果數據不準確。高效液相色譜法檢出限較低，檢測效率較高，為加強食品監管提供了有效技術手段[2]。本文采用高效液相色譜法建立了同時測定食品中7種防腐劑的試驗方法。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

面包、果汁、乳制品和糕點，從市場購買；Ultimate3000高效液相色譜儀，Thermo Scientific；KQ-500DE超聲波振蕩器；TG16離心機；223S電子天平，德國Sartorius公司。

防腐劑標準物：苯甲酸（BA）、脫氫乙酸（DA）、苯甲酸鈉（SB）、山梨酸（PS）、對羥基苯甲酸甲酯（MP）、對羥基苯甲酸丁酯（BP）和對羥基苯甲酸異丁酯（IBP）；甲醇、乙腈、磷酸二氫銨和磷酸二氫鉀等，均為色譜純；氯化鈉，分析純；實驗用水為蒸餾水[3]。

1.2 色譜條件

實驗使用的色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 m×150 mm，3.5 μm），為對色譜柱優化條件進行探索，同時準備了同規格的SunFire C18色譜柱和Symmetry C18色譜柱[4]。在實驗過程中，進樣量達到10 μL，柱溫達到30 ℃，流速達到1 mL·min-1。從流動相類型上來看，可以為甲醇或乙腈，水相可以為磷酸二氫銨或磷酸二氫鉀，分別按照緩沖液∶有機相為80∶20、60∶40、40∶60和20∶80的比例進行實驗，洗脫時間分別在25～30 min、15～22 min、22～25 min和0～15 min，而檢測器波長為230 nm[5]。

1.3 實驗過程

標準溶液配制：取7種濃度為1 000 μg·mL-1的標準溶液1 mL，加水定容到10 mL，定容后可獲得100 μg·mL-1標準混合液。

在樣品前處理階段，考慮到面包等固體樣品油脂含量較高，取經過均質的5 g樣品放入離心管后，添加10 mL正己烷渦旋2 min后將上層去除。針對飲料類的液體樣品，直接稱取5 g樣品移至50 mL離心管，添加20 mL提取液，50 ℃振蕩提取10 min，按照8 000 r·min-1轉速離心3 min[6]。將上層清液移至50 mL離心管中，使用20 mL提取液對剩余殘渣進行提取，離心后，與之前取得的上清液合并[7]。定容到50 mL。過0.22 μm濾膜后，上機。

2 結果與分析

2.1 色譜條件優化

對色譜條件進行優化分析，首先需要對3種色譜柱進行比較。通過實驗發現，使用Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱可更好地分離7種防腐劑。在實驗過程中，發現使用兩種水相溶劑均可用于分離7種防腐劑，但相比較而言使用磷酸二氫銨溶液可更好地分離SB和PS。從有機相的使用情況來看，使用甲醇將更多地保留目標物，但在比例達到80%時才能洗脫，在SB和PS分離方面取得的分離度不超過1。而使用乙腈作為有機相，在比例達到20%時則能達到分離目標物的要求，且對SB和PS的分離度達到了1.5以上。

2.2 實驗方法驗證

在實驗過程中，需驗證使用高效液相色譜法進行7種防腐劑測定時的檢出限、精密度、回收率。

首先，需要對方法線性范圍進行分析，建立標準工作曲線對各種物質的線性相關系數進行確認，如表1所示，線性范圍在0.1～10.0 mg·L-1，證明方法擁有良好線性關系。在S/N=3的信噪比條件下，對方法檢出限展開分析，可知方法檢出限在50～100 μg·L-1，其中苯甲酸、脫氫乙酸的檢出限達到100 μg·L-1，山梨酸檢出限達到60 μg·L-1，其余物質則均為50 μg·L-1。方法檢出限符合檢測要求[8]。

表1 高效液相色譜法測定7種防腐劑的線性范圍表

其次，對方法精密度和回收率進行測定，需要分別稱取4種樣品各3份，對其中1份做空白對照，剩下2份添加0.01 g·kg-1和0.05 g·kg-1的標準溶液，經過前處理后進行樣品測定。如表2所示，方法回收率在71.2%～113.8%，RSD在1.34%～5.92%，說明方法精密度良好。

2.3 樣品分析結果

完成方法有效性驗證后，對4種樣品進行檢測，檢測結果如表3所示。結果表示，4種食品中均含有山梨酸，面包和乳制品中含有苯甲酸，此外這4種食品不含其他防腐劑。從總體來看，食品中防腐劑含量均未超標。

表2 高效液相色譜法測定7種防腐劑的回收率和精密度表

表3 食品中7種防腐劑含量測定結果表（單位：mg·kg-1）

3 結論

應用高效液相色譜法對食品中的苯甲酸、脫氫乙酸、苯甲酸鈉、山梨酸、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丁酯和對羥基苯甲酸異丁酯共計7種防腐劑進行同時測定，通過對色譜條件進行優化，可知采用Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱對目標物進行分離，將磷酸二氫銨作為水相，將乙腈作為有機相，在流動相內對目標物進行梯度洗脫，能夠取得理想分離效果。而在樣品前處理階段，為避免直接進樣給色譜柱帶來不良影響，需使用甲醇進行基質復雜的樣品提取，經濾膜過濾后進樣檢測。此方法線性范圍在0.1～10.0 mg·L-1，線性相關性良好，R2均達到0.999 9以上，同時方法檢出限在50～100 μg·L-1，回收率在71.2%～113.8%，RSD在1.34%～5.92%，體現出了較高精度。