菟絲子總黃酮對大鼠卵巢儲備功能減退的改善作用

頓彩虹， 白愛紅， 謝文燕， 戚靜宜

（1.漯河市婦幼保健院生殖遺傳科，河南漯河 462000；2.洛陽市中心醫院生殖醫學科，河南洛陽 471699）

卵巢儲備功能是指卵巢皮質區域卵泡生長、發育、形成可受精卵泡的功能，反映女性生育潛能及生殖內分泌功能[1]。若卵巢儲備功能下降，將減少卵巢內儲存的可募集卵泡數目，導致卵巢形成卵子的能力減弱、卵泡質量下降，影響女性的生育能力，表現為閉經、月經稀發、不孕甚至卵巢早衰等[2-3]。中醫在調節女性生殖功能失調性疾病方面具有獨到之處，對卵巢儲備功能減退主要從肝腎辨證論治入手，同時兼顧痰濕、氣血等，可促進性腺軸恢復正常，增強卵巢功能，防止出現病理性改變，平衡性激素分泌[4]。菟絲子為旋花科植物菟絲Cuscuta chinensisLam.的種子，味辛、甘，性微溫，入肝、腎經，具有補腎益精、養肝明目、安胎的功效。菟絲子為溫陽補腎之要藥，可改善機體內分泌，增強性功能，具有抗氧化、調節免疫等作用[5]。菟絲子總黃酮為菟絲子的主要成分，現代藥理研究表明，其可改善大鼠生殖內分泌系統損傷[6]，對下丘腦-垂體-性腺軸有多方面作用，可恢復下丘腦-垂體促性腺功能，增加垂體、卵巢對激素的反應性，促進卵泡發育，提高卵巢激素受體數量與功能，有類雌激素樣活性[7-8]。本研究構建卵巢儲備功能減退大鼠模型，旨在探討菟絲子總黃酮改善卵巢儲備功能的作用及其可能機制，以期為臨床應用菟絲子總黃酮改善卵巢儲備功能提供實驗基礎，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SPF級健康雌性SD大鼠68只，21日齡，體質量（50±2）g，購自北京斯貝福生物技術有限公司，生產許可證號：SCXK（京）2019-0010。實驗單位為河南中醫藥大學動物實驗中心。實驗開展前適應性飼養1周，自由攝食水，自然光照。

1.2 藥物、試劑與儀器菟絲子總黃酮（純度＞98%，購自上海譜振生物科技有限公司，批號：20191204）。去氧乙烯基環己烯（4-cinylcyclohexene diepoxide，VCD）、環磷酸腺苷（cAMP）/蛋白激酶A（PKA）信號通路抑制劑H-89（純度＞99%，碧云天生物技術有限公司）；促卵泡激素（FSH）、促黃體激素（LH）、雌二醇（E2）、cAMP酶聯免疫吸附分析（ELISA）試劑盒（上海士鋒生物科技有限公司）；兔抗大鼠卵泡刺激素受體（FSHR）、PKA、磷酸化PKA（p-PKA）、β-actin單克隆抗體（北京中杉金橋生物技術有限公司）；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔免疫球蛋白（IgG）抗體（艾美捷科技有限公司）。電子天平（奧豪斯儀器有限公司）；-80℃超低溫冰箱（美國Thermo Fisher Scientific公司）；恒溫冰凍切片機、EG1150組織包埋機（德國Leica公司）；全波長酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件（美國Media Cybernetics公司）。

1.3 分組與造模68只21日齡的雌性大鼠適應性飼養1周后達28日齡，陰門開啟，經陰道脫落細胞涂片篩查，性周期正常。抽取10只大鼠設為正常組，其余構建卵巢儲備功能減退模型[9]，方法：取VCD溶入芝麻油，配制濃度為80 mg/kg，每天1次，連續腹腔注射15 d，0.2 mL/只。正常組腹腔注射等體積芝麻油，每天1次。造模期間每日上午7∶00—8∶00進行陰道涂片，陰道上皮無動情周期變化，或動情周期明顯延長，則提示卵巢儲備功能減退大鼠造模成功[10]。造模成功大鼠48只，成功率為82.76%，隨機分為抑制劑組、模型組、抑制劑+菟絲子總黃酮組、菟絲子總黃酮組，每組12只。

1.4 干預方法造模成功后次日給藥：抑制劑組灌胃H-89 0.1 mg/kg[11]，菟絲子總黃酮組灌胃菟絲子總黃酮530.1 mg/kg[12]，抑制劑+菟絲子總黃酮組先灌胃菟絲子總黃酮530.1mg/kg再灌胃H-890.1mg/kg，模型組、正常組灌胃等體積生理鹽水，均連續4周，每周休息1 d。

1.5 觀察指標與方法

1.5.1 取材 給藥結束后，用戊巴比妥鈉麻醉大鼠，經腹主動脈取血5 mL。處死大鼠，分離兩側卵巢組織，稱質量。繼而將卵巢組織處理如下：一份液氮冷凍；一份以40 g/L多聚甲醛固定24 h，沖洗后濾紙吸干多余水分，梯度酒精脫水，二甲苯透明，浸蠟，包埋，制作蠟塊保存。

1.5.2 觀察大鼠一般狀況及測定卵巢濕質量、卵巢指數 觀察大鼠一般狀況，包括形態、活動、毛色、體質量等，稱兩側卵巢濕質量，計算卵巢指數，公式：左側（右側）卵巢指數=左側（右側）卵巢濕質量（mg）/大鼠體質量（g）。

1.5.3 ELISA法檢測血清性激素水平 取大鼠腹主動脈血液標本，取血后快速置入促凝管內，室溫靜置1 h，3 000 r/min離心（離心半徑10 cm）10 min，取血清待用。按照ELISA試劑盒說明書檢測血清FSH、LH、E2水平，并計算FSH/LH。應用酶標儀檢測450 nm波長處的吸光度值，計算各指標濃度。

1.5.4 蘇木素-伊紅（HE）染色法觀察卵巢組織形態學變化 取卵巢組織蠟塊，制作5μm切片，展片；干凈玻片撈片，烘干；二甲苯脫蠟，梯度酒精水洗，常規蘇木素染色10 min；水洗，1%鹽酸酒精分色20 s，1%氨水溶液返藍；自來水沖洗15 min，1%伊紅水溶液復染5 min；水洗，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察卵巢形態學變化。

1.5.5 ELISA法檢測卵巢組織中cAMP含量 取液氮冷凍的卵巢組織，勻漿，以3 000 r/min（離心半徑10 cm）離心10 min，取上清。用96孔板，每孔加入50μL抗體，加入10μL標準品，室溫孵育2 h，洗板，顯色，終止，讀板，450 nm波長上機檢測，570 nm波長校正。二喹啉甲酸（BCA）法檢測組織總蛋白濃度，計算各組大鼠卵巢組織中cAMP含量，公式：cAMP含量=ELISA檢測濃度值/各樣本BCA結果。

1.5.6 蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測卵巢組織FSH-cAMP信號軸相關蛋白FSHR、PKA、

p-PKA表達 取液氮冷凍的卵巢組織在冰盒中研磨，勻漿后置入低溫離心機，以4℃、20 000 r/min（離心半徑10 cm）離心20 min，取上清。BCA法檢測蛋白濃度，根據蛋白濃度，按上樣量40μg計算樣本稀釋濃度，沸水浴10 min變性，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳后濕法轉膜。將硝酸纖維素膜置入50 g/L脫脂奶粉中封閉2 h；再取出置入一抗稀釋液[兔抗大鼠FSHR、PKA、p-PKA、β-actin（內參）單克隆抗體，稀釋比例分別為1∶500、1∶1 000、1∶2 500]中孵育過夜；TBST洗膜后，再置入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG二抗（1∶5 000稀釋）中，室溫下孵育1 h；TBST洗膜，電化學發光試劑（ECL）顯色。經成像系統采集硝酸纖維素膜上的蛋白信號，采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件計算目的條帶灰度值。結果以目的蛋白與內參蛋白的灰度值比值表示。

1.6 統計方法采用SPSS 25.0統計軟件分析數據，計量資料以均數±標準差（±s）表示，并進行正態分布檢驗與Levene檢驗。符合正態分布且方差齊者，用單因素方差分析、LSD-t比較，方差不齊者用Welch檢驗、Dunnett’s T3比較。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠一般狀況比較實驗過程中正常組大鼠飲食、活動、二便等情況均正常，皮毛整潔、有光澤，體質量漸增，動情周期規律；模型組大鼠進食、二便次數減少，大便稀，毛色枯燥，有脫毛，體質量漸降，動情周期延長、紊亂，鏡下見上皮細胞增多，多于動情間期；抑制劑組大鼠異常表現較模型組嚴重，抑制劑+菟絲子總黃酮組、菟絲子總黃酮組則相對輕微。

2.2 各組大鼠卵巢濕質量與卵巢指數比較表1

表1 各組大鼠卵巢濕質量與卵巢指數比較Table 1 Comparison of ovarian wet mass and ovarian index of rats in various groups （±s）

表1 各組大鼠卵巢濕質量與卵巢指數比較Table 1 Comparison of ovarian wet mass and ovarian index of rats in various groups （±s）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與抑制劑組比較；③P＜0.05，與模型組比較；④P＜0.05，與抑制劑+菟絲子總黃酮組比較

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結果顯示：各組大鼠卵巢濕質量、卵巢指數組間比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。與正常組比較，抑制劑組、模型組、抑制劑+菟絲子總黃酮組、菟絲子總黃酮組的左側和右側卵巢濕質量及卵巢指數均降低（P＜0.05）。與抑制劑組比較，模型組、抑制劑+菟絲子總黃酮組、菟絲子總黃酮組的左側和右側卵巢濕質量及卵巢指數均升高（P＜0.05）；與模型組比較，抑制劑+菟絲子總黃酮組、菟絲子總黃酮組的左側和右側卵巢濕質量及卵巢指數均升高（P＜0.05）；與抑制劑+菟絲子總黃酮組比較，菟絲子總黃酮組的左側和右側卵巢濕質量及卵巢指數均升高（P＜0.05）。

2.3 各組大鼠性激素水平比較表2結果顯示：各組大鼠FSH、FSH/LH、E2水平組間比較差異有統計學意義（P＜0.05），LH水平組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。與正常組比較，抑制劑組、模型組、抑制劑+菟絲子總黃酮組、菟絲子總黃酮組的FSH、FSH/LH、E2水平升高（P＜0.05）。與抑制劑組比較，模型組、抑制劑+菟絲子總黃酮組、菟絲子總黃酮組的FSH、FSH/LH、E2水平降低（P＜0.05）；與模型組比較，抑制劑+菟絲子總黃酮組、菟絲子總黃酮組的FSH、FSH/LH、E2水平降低（P＜0.05）；與抑制劑+菟絲子總黃酮組比較，菟絲子總黃酮組的FSH、FSH/LH、E2水平降低（P＜0.05）。

表2 各組大鼠性激素水平比較Table 2 Comparison of sex hormone levels of rats in various groups （±s）

表2 各組大鼠性激素水平比較Table 2 Comparison of sex hormone levels of rats in various groups （±s）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與抑制劑組比較；③P＜0.05，與模型組比較；④P＜0.05，與抑制劑+菟絲子總黃酮組比較

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2.4 各組大鼠卵巢組織形態變化比較圖1結果顯示：正常組卵巢體積較大，卵泡生長活躍，黃體發育良好；模型組卵巢萎縮明顯，卵泡數量減少，黃體減少；與模型組比較，抑制劑組卵巢萎縮更明顯，卵泡與黃體數量更少，而抑制劑組+菟絲子總黃酮組、菟絲子總黃酮組卵巢、卵泡與黃體數量明顯改善。

圖1 各組大鼠卵巢組織形態變化比較（HE染色，×100）Figure 1 Comparison of histomorphological changes of ovarian tissue of rats in various groups（by HE staining，×100）

2.5 各組大鼠卵巢組織中cAMP含量比較表3結果顯示：各組大鼠卵巢組織中cAMP含量組間比較差異有統計學意義（P＜0.05）。與正常組比較，抑制劑組、模型組、抑制劑+菟絲子總黃酮組、菟絲子總黃酮組卵巢組織中cAMP含量降低（P＜0.05）。與抑制劑組比較，模型組、抑制劑+菟絲子總黃酮組、菟絲子總黃酮組的cAMP含量升高（P＜0.05）；與模型組比較，抑制劑+菟絲子總黃酮組、菟絲子總黃酮組cAMP含量升高（P＜0.05）；與抑制劑+菟絲子總黃酮組比較，菟絲子總黃酮組cAMP含量升高（P＜0.05）。

表3 各組大鼠卵巢組織中cAMP含量比較Table 3 Comparison of content of c AMP in ovarian tissue of rats in various groups（±s，pmol·mg-1）

表3 各組大鼠卵巢組織中cAMP含量比較Table 3 Comparison of content of c AMP in ovarian tissue of rats in various groups（±s，pmol·mg-1）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與抑制劑組比較；③P＜0.05，與模型組比較；④P＜0.05，與抑制劑+菟絲子總黃酮組比較

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2.6 各組大鼠卵巢組織中FSH-cAMP信號通路相關蛋白表達比較表4、圖2結果顯示：各組大鼠FSHR、p-PKA蛋白相對表達量組間比較差異有統計學意義（P＜0.05），PKA蛋白相對表達量組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。與正常組比較，抑制劑組、模型組、抑制劑+菟絲子總黃酮組、菟絲子總黃酮組的FSHR、p-PKA蛋白相對表達量降低（P＜0.05）。與抑制劑組比較，模型組、抑制劑+菟絲子總黃酮組、菟絲子總黃酮組的FSHR、p-PKA蛋白相對表達量升高（P＜0.05）；與模型組比較，抑制劑+菟絲子總黃酮組、菟絲子總黃酮組的FSHR、p-PKA蛋白相對表達量升高（P＜0.05）；與抑制劑+菟絲子總黃酮組比較，菟絲子總黃酮組的FSHR、p-PKA蛋白相對表達量升高（P＜0.05）。

圖2 大鼠卵巢組織中FSHR、PKA、p-PKA蛋白Western Blot電泳條帶圖Figure 2 Western Blot bands of FSHR，PKA and p-PKA proteins in ovarian tissue of rats

表4 各組大鼠卵巢組織中FSHR、PKA、p-PKA蛋白相對表達量比較Table 4 Comparison of protein relative expression of FSHR，PKA and p-PKA in ovarian tissue of rats in various groups （±s）

表4 各組大鼠卵巢組織中FSHR、PKA、p-PKA蛋白相對表達量比較Table 4 Comparison of protein relative expression of FSHR，PKA and p-PKA in ovarian tissue of rats in various groups （±s）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與抑制劑組比較；③P＜0.05，與模型組比較；④P＜0.05，與抑制劑+菟絲子總黃酮組比較

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3 討論

卵巢作為女性生殖器官，負責卵子的產生與排出，分泌的激素對女性的經、帶、胎、產過程具有調節作用。隨著女性年齡的增長，卵巢功能日漸衰退，致卵巢儲備功能減退，影響受孕能力，甚或伴發閉經并至全身其他系統疾病。卵巢儲備功能減退涉及遺傳、醫源性、環境等影響因素，發病機制目前尚不完全清楚[13]。本研究通過腹腔注射VCD構建卵巢儲備功能減退實驗動物模型，高度模擬了女性卵巢儲備功能減退狀態。可見造模后的大鼠形態、活動、毛色、動情周期等出現異常變化，卵巢濕質量減輕，卵巢指數下降，而經菟絲子總黃酮治療后則明顯改善，提示菟絲子總黃酮可恢復卵巢儲備功能減退大鼠動情周期，增加卵巢質量，糾正降低的卵巢指數，改善卵巢儲備功能。本研究經HE染色觀察大鼠卵巢組織形態學與卵泡情況后發現，模型組卵巢明顯萎縮，卵泡數量減少，閉鎖卵泡增多，而菟絲子總黃酮組卵巢體積增大，皮質內可見大量生長卵泡，較多接近成熟卵泡，提示菟絲子總黃酮可促進卵巢儲備功能減退大鼠卵巢各級卵泡發育。

血清性激素是反映卵巢儲備功能的指標。FSH是腺垂體促性腺激素細胞合成、分泌的糖蛋白類促性腺激素，其分泌可影響卵巢內卵泡的發育、排卵[14]。LH通過與卵巢膜細胞LH受體結合，刺激卵泡膜細胞分泌雄激素，從而為雌激素的產生提供原料。卵巢儲備功能減退初期，FSH、LH均上升，前者早于后者，且更顯著，FSH/LH比值升高則可預判卵巢儲備功能減退。E2由卵巢膜細胞、顆粒細胞分泌，在FSH和LH作用下合成，是評價卵巢儲備功能的常用指標[15]。膜細胞合成的雄激素進入顆粒細胞，在芳香化酶P450作用下轉化為雌激素。長期高E2、FSH/LH水平不利于優勢卵泡發育，因而恢復FSH、E2、LH水平對卵巢早衰的治療十分重要。本研究結果顯示，與模型組比較，菟絲子總黃酮組的FSH、E2、FSH/LH比值下降，提示菟絲子總黃酮具備調節血清性激素功能的作用，體現了其類雌激素樣作用。

卵泡是卵巢局部與循環雌激素的主要來源，雌激素水平受FSH調控，FSH調節卵巢顆粒細胞膜中芳香化酶基因表達，并觸發cAMP依賴的信號級聯調節芳香化酶基因轉錄，誘導雌激素生物合成。FSH-cAMP/PKA信號轉導通路是經典的調節卵巢功能的通路之一，FSH與顆粒細胞上分布的FSHR特異性結合，通過細胞膜上G蛋白受體激活cAMP，增加細胞中cAMP濃度，打破cAMP平衡[16]。據報道[17]，cAMP在卵巢發育過程中可調控卵母細胞成熟與卵泡發育。高濃度的cAMP激活細胞內PKA，活化（磷酸化）的PKA轉錄激活目的基因，促使特異性蛋白合成并分泌至卵巢內，促進卵泡的發育。本研究結果顯示：從抑制劑組到模型組、抑制劑+菟絲子總黃酮組、菟絲子總黃酮組，卵巢組織中FSHR、p-PKA蛋白表達水平及cAMP含量逐漸升高，提示菟絲子總黃酮可能通過調節FSH，激活cAMP/PKA信號轉導通路，增加卵巢局部cAMP含量，促進卵泡發育，從而改善卵巢的儲備功能。

綜上所述，菟絲子總黃酮可能通過激活FSHcAMP/PKA信號轉導通路，發揮對卵巢儲備功能減退大鼠卵巢儲備功能的保護作用。