囊胚培養液中游離DNA的重要染色體整倍性研究

黃錦 加加林 姚雅馨 陸思嘉 黨玉姣 喬杰 劉平

近年來胚胎培養液中存在游離DNA(cell free DNA，cfDNA)已經在生殖領域引起了越來越多的關注[1]。有學者利用囊胚培養液中cfDNA檢測囊胚的整倍性[2-3]。由于胚胎培養液中游離DNA來源復雜而且含量極少，這給檢測胚胎整倍性的準確性帶來困難，也限制了在臨床上的廣泛應用。本文以囊胚培養液cfDNA檢測重要染色體(13、15、16、18、21、22號染色體)整倍性為切入點，探討利用cfDNA檢測囊胚整倍性的效率。

材料與方法

一、材料

本研究共納入239枚囊胚，所有的胚胎均來源于北京大學第三醫院生殖中心的胚胎植入前遺傳學篩查(preimplantation genetic testing for aneuploidy PGT-A)周期。PGT-A指征為女方高齡(>38歲)、復發性流產、反復著床失敗。本研究獲得北京大學第三醫院醫學倫理委員會批準，所有患者均在進入周期前簽署知情同意書。

二、研究方法

1.促排卵和受精方式：按照本中心常規用藥及監測方案進行控制性超排卵，注射HCG后36 h經陰道B超引導下卵泡穿刺取卵。所有周期都采用單精子卵母細胞內注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)方式受精。受精后16 h～18 h觀察受精情況，第三天選擇4細胞以上、碎片<50%的胚胎(多PN來源胚胎除外)進行囊胚培養，第三天或者第四天進行單胚胎單培養滴培養，每個培養滴大約20 uL左右。

2. PGT-A胚胎活檢與遺傳診斷：選擇4期以上、滋養層細胞或者內細胞團其中一項評級為B以上的囊胚(Gardner評分標準[4])進行活檢，激光活檢3～5個滋養層細胞?；顧z的滋養層細胞采用SNP芯片檢測胚胎的整倍性進行遺傳檢測，SNP array 芯片采用ILLUMINA公司的Human CytoSNP 12V-2.1芯片，活檢后的細胞采用多重置換擴增(multiple displacement amplification, MDA)方法全基因組擴增后，雜交至芯片，掃描后的數據采用Illumina Genome Studio軟件分析[5]?；顧z后的囊胚進行玻璃化冷凍。

3.培養液收集與檢測：囊胚活檢后，留取相應的培養液滴至PCR管中，-20℃保存。所有收集的囊胚培養液樣本均進行無創胚胎染色體篩查(noninvasive chromosome screening, NICS)(億康基因公司)檢測整倍性，即先將樣本進行多次退火環狀循環擴增(multiple annealing and looping based amplification cycles，MALBAC)擴增后，采用NGS方法檢測整倍性[6]。

4.統計方法：采用盲法獲得囊胚的PGT-A結果和培養液的NICS結果。本研究著重針對13、15、16、18、21、22號染色體整倍性進行研究。以PGT-A結果為參照指標，分別統計每個囊胚培養液NICS相應染色體結果的真陽性(true positive，TP)(PGT-A、NICS結果均異常)、假陽性(false positive，FP) (PGT-A正常、NICS異常)、真陰性(true negative，TN)(PGT-A、NICS均正常)、假陰性(false negative，FN)(PGT-A異常、NICS正常)等樣本數。進而計算出NICS在檢測這些染色體整倍性的敏感度(sensitivity)、特異度(specificity)、診斷效率(efficiency)、陽性預測值(positive predict value，PPV)和陰性預測值(negative predict value，NPV)。具體計算公式如下:敏感度=TP/(TP+FN)；特異度=TN/(TN+FP)；效率=(TP+TN)/(TP+FP+TN+FN)；陽性預測值=TP/(TP+FP)；陰性預測值=TN/(TN+FN)。

結 果

一、基本情況

本研究納入239枚囊胚，其中209枚囊胚對應的培養液游離DNA有NICS結果，NICS檢出率為87.5%(209/239)。

以209枚囊胚的PGT-A結果做參照，統計這些囊胚13、15、16、18、21、22號染色體NICS結果的真陽性胚胎數、假陽性胚胎數、真陰性胚胎數、假陰性胚胎數，結果見表1。根據公式，計算出這些重要染色體NICS診斷的敏感度、特異度、診斷效率、陽性預測值和陰性預測值，結果見表2。

表1 209枚囊胚重要染色體NICS結果的統計資料

表2 重要染色體整倍性的NICS檢測結果分析(%)

討 論

非整倍體胚胎是導致IVF妊娠率降低，流產率、胎兒畸形率升高的一個重要原因[7]。目前，臨床上利用胚胎植入前遺傳學篩查(PGT-A)技術檢測胚胎的整倍性。但是，PGT需要進行胚胎活檢獲取細胞進行整倍性分析的，對于胚胎是一種有創性的操作，僅在一些特殊人群(如女方高齡、復發性流產、反復著床失敗的患者)中應用。因此，尋求更加微創甚至無創的胚胎診斷方法成為生殖領域的研究熱點。

近年來，有學者發現胚胎的培養液中含有微量的游離DNA，可以反映胚胎的整倍性，為無創胚胎植入前遺傳學檢測提供了前景[1]。但是，臨床上用于培養胚胎的培養液體積很小，內含cfDNA含量極其微少，甚至少于一個細胞的含量，且DNA的狀態存在片段化和碎片化的情況，這都給臨床上的應用帶來困擾。

非整倍體對臨床不良妊娠結局有重要影響。在臨床應用中，不論是PGT還是培養液cfDNA，整倍體的檢測結果引人關注，因為這些對應的胚胎是可利用胚胎。但是對于非整倍體的檢測結果，同樣也要關注非整倍體的具體染色體情況，因為不同染色體的非整倍性情況對胚胎發育及著床有著不同的影響。課題組前期研究顯示[8]，某些非整倍體在胚胎中比例較高，但是在流產的絨毛檢測結果中很少見到(例如16單體、22單體等)，這意味著這些非整倍性狀態嚴重影響胚胎的早期發育和著床；同時也發現，某些非整倍體在胚胎和流產絨毛中的比例均較高(例如16三體、21三體等)，這就意味著這些非整倍體狀態導致流產機會大，因此，對于早期胚胎篩查，應著重關注這些染色體的整倍性。參照無創產前DNA檢測(non-invasive prenatal testing，NIPT)內容,本研究著重研究13、15、16、18、21、22號染色體的非整倍性。

本研究中，以PGT-A的檢測結果為參照，計算cfDNA的NICS檢測結果的敏感度、特異度、陽性預測值和陰性預測值等指標。研究結果顯示，NICS對這些重要染色體檢測的特異性、效率比較高，均>90%，NICS結果的陰性預測值超過97%；但是敏感性波動較大(33%～100%)，陽性預測值較低，<50% (詳見表2)。

這些結果表明，如果cfDNA檢測這些染色體為整倍體，那么對應胚胎這些染色體為整倍體的概率很高(陰性預測值>97%)；但是，如果cfDNA檢測這些染色體為非整倍體，那么對應胚胎這些染色體為非整倍體的概率并不高(陽性預測值<50%)。這些結果也再次表明培養液中cfDNA的細胞來源復雜，利用培養液中cfDNA檢測胚胎的整倍性目前還存在一定局限性，應以胚胎篩查為目的而不是以診斷胚胎為目的。

目前，已經有多項關于培養液cfDNA與囊胚整倍性相關的研究。意大利的研究團隊研究了115枚囊胚培養液cfDNA與滋養層細胞整倍性，一致性可以達到78.7%，敏感度、特異度分別為94.5%和71.7%[9]。Huang等人的研究團隊則比較了滋養層細胞、囊胚培養液中cfDNA以及整個囊胚的整倍性，研究結果顯示，cfDNA檢測結果與整個囊胚的檢測結果的一致率要高于滋養層活檢細胞的檢測結果；但該研究對象是捐贈囊胚，培養液樣本收集是解凍囊胚培養24 h后采樣，這與臨床實際情況存在一定差異[10]。在本研究中，NICS檢出率為87.5%(209/239)，NICS結果與PGT-A結果的一致性并不是高度吻合，分析主要原因在于以下幾點：首先，樣本來源不同，PGT-A檢測的樣本為囊胚滋養層細胞，NICS檢測的樣本是培養液中cfDNA，cfDNA有可能是囊胚細胞釋放，也可能來自于胚胎發育過程中其他細胞的DNA釋放。其次，檢測平臺不同，PGT-A檢測采用MDA全基因組擴增后進行SNP芯片檢測，NICS檢測采用MALBAC全基因組擴增后進行NGS檢測。

探索無創胚胎檢測方法是生殖領域近年來探索的熱點，檢測培養液中cfDNA的整倍性便為其中之一。本文檢測cfDNA的重要染色體(13、15、16、18、21、22號染色體)整倍性為切入點，研究結果提示，NICS方法的特異性和陰性預測值較好，當NICS結果顯示這些重要染色體為整倍體時，對應胚胎該條染色體整倍性概率高；但是當NICS結果顯示這些重要染色體為非整倍體時，對應胚胎并不一定為非整倍體。相信隨著NICS技術不斷提高，該技術有望在臨床中得到應用。