卵巢癌腫瘤干細胞及其標志物與卵巢癌靶向治療的研究進展

關慧鑫 韓世愈

卵巢癌是目前全球范圍內最致命的婦科腫瘤。每年診斷出約240 000例新的卵巢癌病例，其中140 000例患者死于該病[1]。5年總生存率低于45%，晚期卵巢癌患者降至25%[2]。經研究發現有以下3個因素導致卵巢癌的高致死率。首先，由于早期卵巢癌無明顯臨床癥狀，70%的病例在腫瘤已經擴散到腹腔時才被診斷出來[3]。其次，即使在初次減滅手術和以卡鉑/紫杉醇為主的輔助化療后，多數情況下診斷后的兩年內，絕大多數晚期卵巢癌患者都會出現腫瘤復發[4]。第三，與原發腫瘤相比，復發性疾病常對常規化療產生耐藥性，導致治愈率非常低，并導致卵巢癌的高致死率。因此，卵巢癌已成為威脅現代女性健康的一大殺手。腫瘤干細胞(cancer stem cell，CSC)是一種具有自我更新和分化能力的癌細胞亞群，被認為是腫瘤生成，進展，轉移和復發的根源。近年來，隨著對CSC的研究發現，它與卵巢癌的生成，侵襲轉移及耐藥復發有著顯著的關系，尤其是卵巢癌干細胞標志物在卵巢癌的早期診斷及靶向治療中開辟了新的天地。

一、CSC基本概念

1.CSC的發現和來源：CSC又叫做腫瘤起始細胞，占腫瘤細胞總數的0.01%～0.10%，具有無限的增殖潛能。Makino[5]于1959年發現腫瘤細胞可能來源于CSC，并且首次提出CSC假說。CSC假說認為，惡性腫瘤是由CSC經過前體細胞及成熟腫瘤細胞進一步分化而來。Lapidot[6]等人首次分離出了急性髓系白血病的致瘤性干細胞群體，發現其中的單個細胞可使小鼠重新引發白血病，由此證實了CSC的存在。CSC的發現和探究開啟了人類對惡性腫瘤來源，轉移，治療，復發乃至耐藥機理的瘋狂探索，近而為人類盡快攻克癌癥難題開啟了一扇希望之門。

2.CSC特征：人們研究發現CSC像大多數成體干細胞一樣，有著“干細胞”樣特征。成體干細胞即指存在于已分化組織中的未分化細胞，其具有自我更新和分化潛能。而CSC可概括為如下三個特征(1)可使腫瘤的致瘤性增加。(2)無限的自我更新潛能，一般在多次傳代后仍然具有致瘤性。(3)多能性，即CSC注入后形成的腫瘤表面可有其特征性的腫瘤標志物[7]。

二、卵巢癌干細胞(ovarian cancer stem cells，OCSC)基本概念

1.OCSC的發現和來源：2005年，Bapat等人[8]從晚期卵巢癌患者腹水中分離并獲得干細胞樣克隆,同時用低密度培養法獲得了19個永生化的克隆,其中有2個克隆在體外軟瓊脂培養基中培養形成了懸浮生長的細胞球,并且具有CSC的特性，這是OCSC的首次發現。Flesken-Nikitin等人[9]研究結果顯示，OCSC可能來源于卵巢表面上皮細胞，輸卵管上皮細胞及周圍組織中的多能干細胞。女性每次月經周期，卵巢周期性排卵活動中，排卵過程誘導卵巢表面上皮細胞周期性破裂和再生修復，當卵巢表面上皮細胞DNA損傷無法及時修復或修復失敗時，可轉化為CSC。

2.OCSC與卵巢癌：有研究顯示，干細胞基因在卵巢表面上皮及輸卵管上皮中均有顯著表達[10]。這可能是卵巢癌發生的根源所在。女性月經周期卵巢規律性排卵過程中，卵巢上皮細胞不斷重復損傷-修復過程，卵巢中的干細胞不斷增生分化，這一動態過程中若受到炎癥刺激、間質內皮轉化，缺氧等各種腫瘤微環境改變的影響，則有可能導致卵巢干細胞持續增生，停止分化從而引發癌變[11]。同時，CSC具有無限自我更新和增殖分化的能力，其同樣具備轉化成為OCSC，進而導致卵巢癌的發生。

三、卵巢癌干細胞標志物

隨著對卵巢癌的深入了解發現，卵巢癌干細胞表面有一些特異性的表面標志物，與腫瘤的無限增殖，浸潤，轉移乃至耐藥及復發密切相關。研究特異性卵巢癌干細胞標志物是攻克腫瘤難關的關鍵所在。卵巢癌特異性的腫瘤干細胞標志物尚在逐步探索中，現有以下腫瘤干細胞標志物相對較為成熟。

1.CD133(prominin-1)：是一種跨膜糖蛋白，最初被證明是造血干細胞和祖細胞的特異性標記[12]。 同時在成人的多種類型的干細胞中被發現，并被認為可以抑制細胞分化[13]。在卵巢癌中，CD133的表達首先由Ferradina等人[14-15]發現，他們依據抗原表位的不同將其定義為CD133-1和CD133-2 ，同時發現其在卵巢腫瘤組織中的表達高于正常卵巢組織及卵巢良性腫瘤。且CD133+卵巢癌細胞顯示出比CD133-細胞更高的克隆形成能力和增殖潛能[14]。有實驗證明，將原代培養的卵巢癌細胞中CD133+細胞及CD133-細胞同時注入重癥聯合免疫缺陷(severe combined immunodeficiency disease，SCID)小鼠體內，發現CD133+細胞逐漸產生腫瘤特性，且表現出更強的化療抗性。同樣，Curley等人[16]研究表明，從原發卵巢癌中分離的CD133 +細胞能夠使SCID小鼠產生腫瘤。這一系列證據表明CD133是一種腫瘤干細胞標志物，與卵巢癌的發生發展密切相關。CD133是歷史上第一個被研究的腫瘤干細胞標志物，并且它的研究開啟了人類對于卵巢癌的進一步實質性了解，但其具體作用機制仍然在探索中。

2.CD44：是一種完整的膜糖蛋白，是透明質酸(HA)的主要受體。它參與特定的細胞-細胞和細胞-細胞外基質的相互作用，其存在往往與化療耐藥性與腫瘤侵襲性相關[17]，被認為是卵巢癌潛在的腫瘤干細胞標志物。HA和CD44之間的相互作用觸發了多種信號轉導途徑，并參與細胞增殖分化，血管生成與轉移等多種活動。有趣的是，HA的結合刺激Nanog的CD44募集，Nanog是一種調節多種腫瘤干細胞樣特征和化學耐藥性的轉錄因子。 與CD44的相互作用誘導Nanog的激活和核易位，導致其癌基因的表達[18]。HA-CD44相互作用還促進質膜上信號結構域的形成，從而激活受體酪氨酸激酶介導的信號傳導，如EGFR-Ras-ERK途徑[19]，從而有助于腫瘤干細胞的增殖和侵襲。在有關卵巢癌的研究中發現，復發性卵巢癌與原發性相比，CD44表達水平更高[20]，且經過紫杉醇治療后的復發腫瘤中也存在CD44的過表達，可見CD44與化療耐藥相關。同時研究表明，CD44的表達與患者無進展生存期及總生存期下降密切相關。特別是在卵巢癌中，研究發現CD44v6在卵巢癌腹膜轉移中的表達上調，更重要的是，一部分CD44v6+腫瘤細胞顯示出轉移啟動活性[21]。Zhou等人進一步研究發現CD44v6與卵巢癌的組織學分級，FIGO分期及5年生存率相關，提示CD44v6是預后不良的重要標志物[22]，同樣Wang 等人[23]經研究發現CD44v6的過表達與漿液性卵巢癌的不良預后密切相關。綜上所述，CD44被認為是卵巢癌的潛在腫瘤干細胞標志物是無可非議的。

3.CD47：是一種跨膜蛋白，是信號調節蛋白-α(SIRP-α)的配體，可分泌基質細胞蛋白凝血酶敏感蛋白-1[24]。 CD47是所有人類癌癥中過表達的表面標志物，因為它與SIRP結合，向吞噬細胞發送“別攻擊我”信號，抑制巨噬細胞介導的破壞，逃避免疫監視，這是CSC導致腫瘤發生的最重要步驟[25]。CD47的上調是腫瘤干細胞用于逃過免疫系統的一種重要的機制，其在癌癥復發中起關鍵作用[26]。在實體腫瘤中，如卵巢癌，乳腺癌，結腸癌，膀胱癌，前列腺癌，膠質母細胞瘤和肝細胞癌中，CD47的表達增加也是預后不良的一個獨立危險因素[25]。同樣有學者發現，高表達CD47與高級別漿液性卵巢癌患者的不良預后相關[27]。

4.CD24：熱穩定抗原CD24(一種糖基磷脂酰肌醇錨定的膜糖蛋白)已被廣泛用作各種癌癥類型中CSC的標志物，包括結直腸癌，胰腺癌，鼻咽癌及卵巢癌。不同實驗室結果均表明CD24有望成為卵巢癌腫瘤干細胞的標志物。Burgos-Ojeda[28]等人，使用基于組織特異性缺失Trp53，Pten和Apc的卵巢癌小鼠模型，鑒定得出CD24+細胞為腫瘤起始細胞。Gao等人通過進一步研究，從卵巢癌標本中分離出CD24+細胞亞群，并證明該細胞亞群有較高的干細胞相關基因表達，更重要的是，它具有較高的致瘤能力[29]。Li等人通過對已建立的卵巢癌細胞系進行研究，不僅表明CD24在成球細胞表達中增加，而且進一步驗證敲除CD24將影響其克服失巢凋亡及球形成能力[30]。同時有研究顯示，在卵巢癌腹水中的腫瘤細胞表達的CD24水平高于實體腫瘤，這被認為是CSC特征富集的標志[31]。Moulla等人[32]進一步通過研究發現CD24的過表達與卵巢癌的腫瘤分級及患者的不良預后密切相關，這表明CD24可作為潛在的卵巢癌干細胞標志物，為卵巢癌的診斷，治療及預后帶來希望。

5.乙醛脫氫酶(ALDH)：是促進醛底物氧化成相應羧酸的酶。在ALDH家族中，ALDH1亞群在正常和CSC中特別活躍。特別是在ALDH1同工酶(ALDH1A1、ALDH1A2和ALDH1A3)中，ALDH1A1在CSC中有顯著表達[33]。ALDH1可以作為腫瘤細胞抵抗化學治療劑的分子泵，從而增加腫瘤的耐藥性。來自Condello等人的研究，提示OCSC中的ALDH1A1在轉錄水平上受到Wnt/β-catenin途徑的調節，并顯示小分子ALDH1A1抑制劑消除了球形成能力，表明ALDH1A1是潛在的治療靶點[34]。進一步研究發現在卵巢癌細胞系中敲除ALDH1A1恢復了卵巢癌細胞對化療藥物的敏感性[35]，從而明確ALDH1A1與卵巢癌的化療耐藥性相關。此外，敬宏等人研究結果顯示 ，ALDH1在卵巢癌組織中存在過表達，且表達水平與卵巢癌的臨床分期及淋巴結是否轉移密切相關，同時，ALDH1的表達與CD117、CD133的表達存在交叉重疊，提示ALDH1有可能成為潛在的卵巢癌干細胞標志物[36]。

6. CD117：又被稱為c-kit，是一種參與細胞信號轉導的III型受體酪氨酸激酶。它參與細胞的各種活動，包括細胞凋亡，細胞分化，增殖和細胞粘附[37]。有文獻報道顯示，在卵巢癌中CD117的表達明顯增高[8]。Luo等人進一步研究發現CD117+卵巢癌細胞比CD117-在異種移植模型中更具有自我更新、分化和腫瘤再生的能力[38]。還有報道指出，卵巢CSC中CD117是引起順鉑/紫杉醇類化療耐藥的根源所在[39]。因此，CD117被認為是卵巢癌腫瘤干細胞的潛在標志物，抑制CD117的表達可能成為未來治療卵巢癌一種新的有效方法。

四、卵巢癌的靶向治療

卵巢癌以高致死率，高復發率，高耐藥率居女性婦科腫瘤之首。化療等輔助治療是除手術之外治療卵巢癌的主要方法。但其化療緩解后的再復發給患者帶來了巨大的困擾。少數耐藥的腫瘤干細胞被認為是卵巢癌復發的根源所在。因此，針對卵巢癌腫瘤干細胞標志物的靶向治療開啟了卵巢癌治療的新方向。

1.CD133作為靶點：Baba等人[40]研究發現CD133的表達受表觀遺傳修飾的直接調控，包括DNA甲基化和組蛋白修飾。 對卵巢癌細胞系用 DNA甲基化酶抑制劑地西他賓處理，發現CD133mRNA轉錄水平升高，CD133陽性細胞增多，說明可以利用表觀遺傳學方法對這群細胞進行監測或調控，促進腫瘤干細胞的分化，極大可能減少卵巢癌的復發，為卵巢癌的治療開辟新的途徑。有實驗表明，將小鼠體內繁殖的抗人CD133抗體與細胞毒性藥物MMAF結合，二者協同作用通過誘導細胞凋亡來抑制癌細胞的生長[41]。

2.CD44作為靶點：CD44是一種與HA結合的表面粘附分子，與腫瘤的浸潤和轉移有關。目前已經開發了幾種針對CD44v6亞型的抗體，并且已經用于頭頸部鱗狀細胞癌患者的I期臨床試驗中[42]。同時HA與紫杉醇的生物結合物正被研究以增強細胞毒性藥物選擇性地進入表達CD44的卵巢癌細胞，并用于卵巢癌的腹膜內治療[43]。

3.CD47作為靶點：在各種異種移植腫瘤模型中，人CD47阻斷單克隆抗體已被證明對多種腫瘤有很好的療效，包括白血病，淋巴瘤，膀胱癌及乳腺癌等[44]。研究顯示通過阻斷CD47-SIRPα通路可治療各種CD47高表達的腫瘤，是腫瘤靶向治療的潛在靶點。Hongrapipat等人[45]研究發現，在卵巢癌OVCAR-3細胞系中，將化療藥物及光動力療法藥物與抗CD47抗體 Fab′結合可使卵巢癌細胞對藥物的反應性提高，為CD47在卵巢癌中的靶向治療奠定了基礎，因此CD47有望成為卵巢癌靶向治療的潛在靶點。

4.CD24作為靶點：CD24是粘蛋白型粘附分子，與腫瘤轉移能力相關[46]。有研究證實抗CD24抗體SWA11使肺癌細胞A549和胰腺癌細胞BxPC3的異種移植小鼠的腫瘤體積明顯減小[47]。2009年，Su等人成功應用短發夾RNA(shRNA)來敲低CD24的表達，CD24的敲低促進了卵巢癌細胞系SKOV3的細胞凋亡，從而降低了細胞增殖活力，同時抑制了卵巢癌小鼠的腫瘤生長[48]。 因此，有效抑制CD24可能成為卵巢癌靶向治療的有效方法之一。

5.ALDH作為靶點：ALDH可保護細胞免受致癌物質的侵害[49]。有實驗表明，在小鼠卵巢癌模型中敲低ALDH1A1的表達可恢復卵巢癌細胞系的化療敏感性[35]。因此，ALDH的抑制劑也被認為是一種新的靶向治療方法。例如，雙硫侖，一種ALDH抑制劑，與吉西他濱聯合應用對多形性膠質母細胞瘤具有協同的細胞毒作用[50]。此外，雙硫侖不僅可以優先殺死ALDH+的卵巢癌干細胞，并且可與順鉑協同應用用于卵巢癌的治療。

6.CD117作為靶點：伊馬替尼是一種有效的CD117(c-KIT)特異性抑制劑，已用于多種類型癌癥的臨床試驗中，其中包括卵巢癌[51]。 Patel等人[52]研究發現，甲磺酸伊馬替尼在卵巢癌A2780細胞系中參與復雜的細胞活動，包括細胞代謝，細胞周期，細胞增殖，細胞凋亡和細胞信號轉導。因此，CD117可能是酪氨酸激酶抑制劑伊馬替尼的完美治療靶點，可能為未來卵巢癌的靶向治療帶來新的希望。

五、小結與展望

既往的相關研究中，有關卵巢癌腫瘤干細胞標志物的研究取得了不小的進展。在有關專家的共同努力之下，成功分離并培養出了腫瘤干細胞，并篩選出了潛在的可能成為卵巢癌腫瘤干細胞的標志物。但這些遠遠不夠，其具體作用機制及靶向治療的研究仍需進一步探究。首要任務是繼續尋找并篩選出卵巢癌的特異性腫瘤干細胞標志物，近而更早期準確的發現腫瘤，從而更精準的實現靶向治療，為卵巢癌患者的精準治療開辟新的途徑。