毛鉤藤堿對H2O2誘導的大鼠心肌細胞氧化應激損傷的保護作用及機制

丁露，馬羅平，孟明星，王磊，姜盛，關智敏，張廷彩，李娜

1.湖北文理學院 基礎醫學院，湖北 襄陽 441053；2.溫州醫科大學 基礎醫學院，浙江 溫州 325035；3.溫州醫科大學附屬第一醫院 心胸外科，浙江 溫州 325015；4.濰坊高新技術產業開發區人民醫院 科教科，山東 濰坊 261000

心肌梗死作為冠心病中最嚴重的類型，是人類死亡的主要原因[1]。目前通過再通血管，恢復心臟血流，達到治療目的。但再通術后往往伴隨心肌損傷這一術后病理改變，被稱為心肌缺血/再灌注（ischemia/reperfusion, I/R）損傷，嚴重影響再通后的治療效果[2-3]。研究表明，心肌I/R會引發氧化應激，導致心肌細胞出現壞死和凋亡，對心肌梗死病死率產生顯著影響[4]。因此，干預氧化應激下心肌細胞發生的凋亡是提高心肌梗死治療效果，改善預后的重要手段。鉤藤是我國傳統中藥，具有預防和治療心血管疾病的藥理作用，毛鉤藤堿（hirsutine,HS）作為其主要的生物成分，是一種新型生物堿單體化合物[5]。WU等[6]發現，HS具有保護缺氧誘導的心肌損傷的作用。基于這一研究基礎，本研究將探討HS對H2O2誘導的心肌細胞氧應激損傷的影響及其作用機制，為其成為治療心肌損傷的化合物提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動物：SPF級SD大鼠，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，放置在溫州醫科大學動物實驗中心飼養繁殖，實驗動物許可證號：SCXK（浙）2010-0044。

1.1.2 實驗試劑：高糖DMEM培養基、胎牛血清、胰蛋白酶（美國Gibco公司），膠原酶（美國Sigma公司），細胞計數試劑盒8（cell counting kit-8, CCK-8）購自上海碧云天公司，Fluo-488-Tunel試劑盒購自上海碧云天公司；BrdU購自美國Sigma公司；兔抗大鼠Bcl-2、Bax、Cleaved-caspase 3、Caspase 3、核因子E2相關因子-2（nuclear factor E2-related factor 2, Nrf2）、血紅素加氧酶-1（heme oxygenase-1, HO-1）、GAPDH抗體以及辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG均購于美國Cell Signaling Technology公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠乳鼠原代心肌細胞的培養：將出生1～ 2 d的大鼠乳鼠浸泡于乙醇消毒后，開胸取心臟，剪除心房洗盡血液，剪碎組織加入4 mL 20%的膠原酶消化3次，每次10 min，棄去前兩次細胞懸液，第3次消化后將細胞懸液離心，收集沉淀，DMEM重懸后，過 濾放置25T的培養瓶中進行培養。靜置培養2 h后，吸取未貼壁的心肌細胞懸液加入BrdU（0.1 mmol/L）用于抑制成纖維細胞增殖，接種到新的培養板靜置培養。由于心肌成纖維細胞的貼壁速度和時間比較難掌握，受組織消化程度影響大，心肌細胞純度會有所差異。為控制原代細胞純度，待細胞幾乎全部貼壁后，篩選出狀態良好且自發搏動細胞占總細胞85%以上的培養皿，進行后續實驗[7]。

1.2.2 H2O2誘導心肌細胞氧化應激損傷模型的建立：采用終濃度為400 μmol/L的H2O2溶液誘導細胞構建氧化應激損傷模型[8]。觀察加入的H2O2溶液1、 2、6、12、24 h后細胞狀態，確立本細胞氧化應激損傷的最佳條件。

1.2.3 HS處理及分組：參考吳利新等[6]所用的濃度，加入不同濃度的HS處理原代心肌細胞，設為H2O2+0.1 μmol/L HS組、H2O2+1 μmol/L HS組、H2O2+ 10 μmol/L HS組、H2O2+100 μmol/L HS組，并設HS組（10 μmol/L）作為對照。

1.2.4 CCK-8法檢測細胞活性：將細胞以每孔5 000個接種于96孔板，于37 ℃、5% CO2細胞培養箱中培養。每孔加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃培養1 h，用酶標儀檢測各孔450 nm波長處，測定吸光度值。每組設5個復孔，同時設置調零孔和對照孔。細胞存活率=加藥孔吸光度值/對照孔吸光度值×100%。

1.2.5 Tunel法檢測細胞凋亡情況：制作細胞爬片，浸入4%的多聚甲醛室溫（15～25 ℃）固定20 min，按照試劑盒說明，設置陽性對照及陰性對照組，于熒光顯微鏡（Leica，DM-500）下拍攝圖片。采用 ImageJ軟件計算細胞凋亡率，并進行統計分析。

1.2.6 心肌細胞α-sarcomeric actin蛋白表達量的檢測：將制作的細胞爬片，浸入4%的多聚甲醛，室溫（15～25 ℃）固定20 min，用PBS清洗3次，加入α-sarcomeric actin一抗，4 ℃過夜孵育，次日加入Fluo-488標記的熒光二抗，孵育1 h。熒光鏡下進行拍照并采集圖像。

1.2.7 蛋白質印跡（Western blot）法檢測凋亡相關蛋白：用加入蛋白酶抑制劑的強效裂解液裂解細胞，制成蛋白上樣品，進行定量、電泳、轉膜，5%脫脂牛奶封閉1 h，然后用目的抗體按照一定比例稀釋后，4 ℃孵育過夜。次日用辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育1 h。轉染上蛋白的膜采用化學發光法顯影，凝膠成像系統拍攝照片。以目的蛋白條帶灰度值與GAPDH條帶灰度值的比值來反映凋亡蛋白的表達水平。

1.3 統計學處理方法 采用SPSS22.0對數據進行統計學分析，用Prism Graph軟件分析作圖。正態分布數據用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組心肌細胞活力的影響 與Control組比，H2O2組在6、12和24 h細胞活性顯著降低，差異有統計學意義（均P＜0.05）；最終選取400 μmol/L H2O2刺激12 h構建原代心肌細胞的氧化應激模型，見圖1A。與H2O2組比，HS濃度為1 μmol/L、10 μmol/L時可顯著增加細胞的活力，差異有統計學意義（均P＜0.05）；HS濃度為100 μmol/L時，細胞活力反而顯著下降，差異有統計學意義（P＜0.01），見圖1B。因此，選取10 μmol/L作為后續實驗中HS的濃度。

2.2 HS對各組心肌細胞凋亡的影響 熒光顯微鏡下觀察發現，與Control組比，HS組細胞無明顯變化，H2O2組細胞體積較小，細胞核固縮，Tunel染色呈陽性的細胞較多，差異有統計學意義（P＜0.05）。與H2O2組比，H2O2+HS組細胞核形態正常，Tunel染色呈陽性的細胞數量顯著減少，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖2。

圖2 HS對各組心肌細胞凋亡的影響

2.3 HS對心肌細胞α-sarcomeric actin的表達影響 對心肌細胞進行α-sarcomeric actin綠色熒光染色，與Control組比，H2O2組細胞染色結果提示，心肌肌節解聚現象明顯，心肌細胞橫紋肌結構破壞；而H2O2+HS組此現象有所緩解，見圖3。

圖3 各組心肌細胞α-sarcomeric actin表達的熒光染色

2.4 HS對各組心肌細胞凋亡相關蛋白的表達影響 與Control組比，H2O2組心肌細胞Bax/Bcl-2、Cleaved-caspase 3/Caspase 3比值顯著上調，差異有統計學意義（P＜0.01）；與H2O2組比，H2O2+HS組Bax/Bcl-2、Cleaved-caspase 3/Caspase 3比值顯著下調，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖4。

圖4 HS對心肌細胞各凋亡相關蛋白表達的影響

2.5 HS對心肌細胞Nrf2和HO-1蛋白相對表達水平的影響 與Control組比，H2O2組心肌細胞Nrf2、HO-1蛋白表達水平降低，差異有統計學意義（P＜0.05）；與H2O2組比，H2O2+HS組心肌細胞Nrf2、HO-1蛋白表達水平增加，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖5。

圖5 HS對各組心肌細胞Nrf2和HO-1蛋白表達的影響

3 討論

鉤藤是我國傳統中藥，臨床上作為羚角鉤藤湯、麻黃鉤藤散、天麻鉤藤飲、瀉肝安神湯等方劑的主要成分，可以用來治療哮喘、癲癇、高血壓等疾病。鉤藤中具有顯著藥理作用的主要是以鉤藤堿為代表的吲哚類生物堿[5]。隨著藥理學的發展，通過高效液相提取分離的方法可以從鉤藤堿中分離提取一種新型生物堿單體化合物即HS。HS是否與鉤藤一樣具有預防和治療心血管疾病的藥理作用，目前研究較少。WU等[6]發現，HS具有保護缺氧誘導的心肌損傷的作用，其作用機制與抗氧化、減少心肌細胞發生線粒體凋亡有關。基于這一研究基礎，本研究探討HS對H2O2誘導的心肌細胞氧應激損傷的影響及其作用機制，為其成為治療心肌損傷的化合物提供理論依據。

氧化應激與心血管疾病的發生、發展有著密切關系，其所導致的心肌細胞損傷是疾病發生發展的重要機制之一，嚴重影響了心肌梗死后血管再通后的治療效果[9]。因此，干預氧化應激以減少心肌細胞損傷成為心血管疾病治療的研究熱點[10]。H2O2誘導心肌細胞，是很成熟的構建氧化應激細胞損傷模型的方法[8]。本研究提取大鼠乳鼠原代心肌細胞，借鑒文獻方法[11]采用400 μmol/L H2O2處理原代心肌細胞，并設置了不同時間點，以確認本實驗提取的原代心肌細胞對H2O2的耐受情況。CCK-8檢測結果顯示，400 μmol/L H2O2處理12 h，即能抑制細胞活力，也不會讓細胞大量凋亡，因此，采用 400 μmol/L H2O2處理12 h，作為本實驗的氧化應激損傷模型。同時，CCK-8檢測結果發現HS在1 μmol/L、 10 μmol/L濃度時均可顯著改善H2O2誘導的心肌細胞活性降低的情況，0.1 μmol/L的濃度對細胞活性無顯著改善效果，而HS濃度達到100 μmol/L時，細胞活力反而下降。該結果說明，HS可以保護H2O2誘導的心肌細胞的損傷，且該保護作用呈現劑量依賴性，10 μmol/L時效果最佳。氧化應激反應對細胞的損傷作用主要體現在誘導細胞壞死和凋亡。本研究采用Tunel對細胞進行染色，檢測細胞發生凋亡的情況。結果顯示，HS具有抑制H2O2誘導的心肌細胞凋亡的作用，與WU等[6]在缺氧誘導乳鼠心肌細胞凋亡模型中的結果一致。前面有研究展示，HS可以調控IL-6/STAT3信號通路抑制結腸癌細胞增殖、遷移及誘導細胞凋亡[11]；可以通過線粒體途徑誘導乳腺癌MDA-MB-231細胞凋亡[12]；可以通過ROCK1/PTEN/PI3K/GSK3β途徑誘導人肺癌細胞的凋亡[13]。這些研究中的HS的劑量分別達到20、40和60 μmol/L，本研究的有效濃度為10 μmol/L，濃度達到100 μmol/L時不僅失去保護作用且產生細胞毒性，使細胞發生嚴重損傷。說明HS的抗凋亡作用對濃度有極強的依賴性，不同濃度的藥理學效果甚至可以呈現出相反的效果。

α-sarcomeric actin是一種分布于肌節Z線處的細胞骨架蛋白，具有收縮功能，分布廣泛，主要存在于胚胎及新生動物心肌中，是心肌細胞的特異性蛋白[14]。骨架蛋白的完整性可以確保心肌細胞功能的健全，本實驗采用α-sarcomeric actin經免疫熒光染色，以觀察心肌細胞微結構的狀態。結果可以直觀看到HS逆轉了H2O2誘導下心肌細胞肌節解聚的狀態，說明HS對氧化應激所致的大鼠心肌細胞微結構的損傷起保護作用。

細胞凋亡又稱為細胞程序性死亡，可分為外源性途徑和內源性途徑兩種：外源性途徑主要依賴于死亡受體（death receptor，DR），故又稱為死亡受體途徑；內源性途徑主要依賴于線粒體的損傷，故又稱為線粒體途徑。目前已知，氧化應激會觸發氧化呼吸鏈解偶聯，產生過量ROS，ROS積聚造成線粒體滲透性轉換孔（mPTP）開放，引起線粒體膜電位去極化，激活線粒體凋亡執行通路，誘發細胞凋亡[15]。抗凋亡蛋白Bcl-2，促凋亡蛋白Bax、Caspase 3以及Cleaved-caspase 3都是公認的反映細胞凋亡活性的重要指標。Bax/Bcl-2、Cleavedcaspase 3/Caspase 3比值增高，說明細胞線粒體凋亡過程啟動。本研究通過免疫印跡法檢測了抗凋亡蛋白Bcl-2，促凋亡蛋白Bax、Cleaved-caspase 3的表達量，結果顯示HS可以下調Bax/Bcl-2，Cleaved-caspase 3/Caspase 3蛋白水平的上升，說明其具有抑制線粒體凋亡啟動作用。Nrf2/HO-1信號軸是調控氧化應激性疾病的重要的信號通路，Nrf2可通過促進下游HO-1發揮抗氧化作用[16]。本研究結果顯示，與Control組相比，H2O2組Nrf2、HO-1蛋白表達受到抑制，而HS則能促進Nrf2、HO-1的蛋白表達。說明HS可能通過Nrf2/HO-1途徑發揮抗氧化作用，保護氧化應激所致心肌細胞發生的線粒體凋亡。

HS對H2O2誘導的心肌細胞氧化應激損傷具有保護作用，其機制可能通過Nrf2/HO-1信號通路抗氧化以抑制線粒體途徑凋亡的發生。