高效液相色譜法測定混合重組人胰島素注射液中異天冬氨酸的含量*

晏菊姣，王婧，張一唱，喻悅，周朝暉，李恒

(1.武漢藥品醫療器械檢驗所，國家藥品監督管理局藥物制劑質量研究與控制重點實驗室，武漢 430075；2.美國東北大學化學與生物化學系，巴奈特化學與生物分析研究所，波士頓 02115)

糖尿病是一種以高血糖為特征的代謝性疾病，其中1型糖尿病主要表現為胰島β細胞的功能受損，主要是體內胰島素的絕對缺乏，其患者主要通過注射胰島素進行治療。魚精蛋白是以精氨酸為主的30多種氨基酸組成的堿性多肽混合物[1]，在含有少量鋅離子和苯酚的中性條件下，帶負電荷的胰島素與帶正電荷的硫酸魚精蛋白結合形成棒狀晶型的白色沉淀，使其在人體液中溶解度降低從而達到延時釋放的目的[2]?；旌现亟M人胰島素注射液是雙時相胰島素制劑[3]，是將普通胰島素(regular insulin，RI)與魚精蛋白鋅胰島素(protamine zinc insulin，PZI)按一定比例混合而成，從而得到一個來自速效或短效部分的餐時胰島素以及中效部分的基礎胰島素，發揮餐時胰島素和基礎胰島素的效果。重組人胰島素由51個氨基酸組成，含有3個天冬酰胺(Asn)殘基，可能發生脫酰胺化反應，從而改變其結構和功能，導致其活性下降[4-6]。脫酰胺作用的程度可由蛋白中形成的異天冬氨酸(isoaspartic acid，isoAsp)濃度反映[6]?；旌现亟M人胰島素注射液中既有RI，又有PZI，魚精蛋白與胰島素的結合可能使胰島素的結構發生變化，從而使isoAsp的檢測更加復雜。生物技術藥物近年來蓬勃發展，為人類戰勝疾病發揮積極意義，我國對生物技術藥物中脫酰胺化的研究處于探索階段，歷版《中華人民共和國藥典》及法規未對脫酰胺的檢測和評價方法形成明確規定。筆者在本研究選取混合重組人胰島素這種分子量較小的生物藥作為研究目標，測定其脫酰胺化產生的isoAsp含量，為研究其他更大分子量的生物技術藥物中脫酰胺化提供借鑒與參考。

1 試藥與儀器

1.1試藥 30/70混合重組人胰島素注射液(商品名：甘舒霖?30R，通化東寶藥業股份有限公司，批號：3M12019065353，3M12020086763)；精蛋白鋅重組人胰島素混合注射液(商品名：優泌林?70/30，Lilly France，禮來蘇州制藥有限公司分裝，批號：C924352A，D135743A)；精蛋白重組人胰島素混合注射液(30/70)(商品名：優思靈，珠海聯邦制藥股份有限公司中山分公司，批號：202007C117)；精蛋白鋅重組賴脯胰島素混合注射液(25R)(商品名：優泌樂?25，Lilly France生產，禮來蘇州制藥有限公司分裝，批號：D215343)；精蛋白鋅重組賴脯胰島素混合注射液(50R)(商品名：優泌樂?50，Lilly France生產，禮來蘇州制藥有限公司分裝，批號：D179806A，D176504A)；重組人胰島素標準品(批號：140633-201907，規格：27.2 U·mg-1)；賴脯胰島素標準品(批號：140729-201702，規格：27.6 U·mg-1)，購自中國食品藥品檢定研究院；ISOQUANT?Isoaspartate Detection Kit，MA1010[Promega公司，批號：0000387327，包含S-腺苷-L-高半胱氨酸(S-adenosyl-homocysteine，SAH)(14.97 μmol·L-1)、Isoasp-DSIP(96.1 μmol·L-1)、S-腺苷-L-甲硫氨酸(S-adenosyl-methionine，SAM)(1 mmol·L-1)、異天冬氨酸甲基轉移酶(protein isoaspartate methyltransferase，PIMT)、5倍反應緩沖液，0.3 mol·L-1磷酸]；牛胰蛋白酶(Sigma-Alderich公司，批號：SLBG6452V)；磷酸二氫鉀(批號：20190509)、磷酸氫二鉀(批號：20180109)、無水硫酸鈉(批號：20181023)、磷酸(批號：20160425)、乙醇胺(批號：20200807)均為分析純試劑，鹽酸(批號：20190118)優級純，購于國藥集團化學試劑有限公司；甲醇色譜級(Scharlau公司，批號：20277613)；超純水。

1.2儀器 Agilent 1260 Infinity Ⅱ高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司)，METTLER TOLEDO XS205BU電子天平(梅特勒-托利多儀器公司，感量：0.01 mg)，METTLER SevenEasy pH計(梅特勒-托利多儀器公司)，ELGA純水機，VORTEX-Kylin-Bell渦旋儀(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)，DK-S26電熱恒溫水浴鍋(上海精宏實驗設備有限公司)，SK250LHC超聲波清洗儀(上?？茖С晝x器有限公司)，R1750R高速離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司)。

2 方法與結果

2.1溶液的制備

2.1.1磷酸鉀緩沖液 取磷酸二氫鉀1.08 g，磷酸氫二鉀0.25 g，加水使溶解并稀釋至1000 mL，用磷酸調節pH值至6.2[7]。

2.1.2胰蛋白酶溶液 取牛胰蛋白酶適量，加50 mmol·L-1醋酸-磷酸鉀緩沖液(pH值6.2)(1：9)溶解，并制成含胰蛋白酶2 mg·mL-1的溶液。

2.1.3Isoasp-DSIP對照品溶液 取試劑盒中Isoasp-DSIP對照品，用水稀釋20倍，制備含Isoasp-DSIP 4.805 μmol·L-1的溶液(冰上配制)。

2.1.4主反應混合物(master mix，MM)溶液 取SAM適量，用水稀釋10倍，制成100 μmol·L-1的SAM溶液，再依次加水、5倍反應緩沖液、SAM溶液、PIMT按1：1：1：1制備混合溶液(冰上配制)。

2.1.5SAH對照品溶液 用水稀釋SAH對照品，制備濃度分別為0.25，0.50，0.75，1.25，2.50，3.75 μmol·L-1系列SAH對照品溶液適量，置200 μL進樣瓶中。

2.2酶反應

2.2.1胰蛋白酶消化 取甘舒霖?30R(批號：3M12019065353)且室溫放置30 min，搖勻，精密量取200 μL，加入胰蛋白酶溶液4 μL，混勻，作為樣品溶液。同時取超純水同法制備空白樣品溶液。將上述兩種溶液，在37 ℃孵育1 h，立即置-18 ℃冰箱中止反應。

2.2.2PIMT反應 取經“2.2.1”項下消化后的樣品溶液、空白樣品溶液和Isoasp-DSIP對照品溶液各30 μL，分別置200 μL離心管中，各加入MM溶液 40 μL，輕輕渦旋混勻，離心(4 ℃，12 000 r·min-1)，以確保所有液體均在管底。將離心管置于30 ℃水浴中保持30 min。取出放置冰上，立即加終止液(0.3 mol·L-1磷酸)10 μL，放置5～10 min至反應完全，輕輕渦旋混勻，離心(4 ℃，12 000 r·min-1，有效離心半徑8.56 cm)，取上清液置200 μL進樣瓶中(避光保存)。

2.3HPLC檢測

2.3.1色譜條件 用十八烷基鍵合硅膠為填充劑：Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱(150 mm ×4.6 mm，5 μm)；柱溫：25 ℃；流速：1.0 mL·min-1；采用DAD檢測器，檢測波長：260 nm。以甲醇和磷酸鉀緩沖液為二元溶劑體系，梯度洗脫：0～2 min，10%甲醇；>2～10 min，10%→30%甲醇；>10～12 min，30%→90%甲醇；>12～13 min，90%甲醇。

2.3.2測定法 取各SAH對照品溶液、“2.2.2”項下4種溶液各20 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，見圖1。

A.SAH對照品；B.樣品；C.isoAsp-DSIP對照品；D.空白；1.SAH。圖1 混合重組人胰島素注射液isoAsp含量檢測HPLC色譜圖A.SAH reference；B.Sample；C.isoAsp-DSIP reference；D.blank control；1.SAH.Fig.1 HPLC chromatograms of isoAsp quantification in mixture of recombinant human insulin injection

2.3.3線性關系考察 精密量取濃度為0.25，0.50，0.75，1.25，2.50，3.75 μmol·L-1系列SAH對照品溶液，按照“2.3.1”項色譜條件，進樣20 μL，記錄色譜圖，以所得 SAH峰面積為縱坐標(Y)，SAH進樣量(X)為橫坐標，繪制標準曲線，線性方程為Y=0.893 2X-0.886 0，r=0.999 3，結果顯示SAH對照品濃度在0.25～3.75 μmol·L-1，線性關系良好。

2.3.4精密度和穩定性 為了確保整個過程的準確性和穩定性，實驗中總共進樣6次2.5 μmol·L-1SAH對照品溶液，開始、中間和結束時各2次(10 h)，以便在實驗的不同階段考察系統的適用性。結果保留時間為(5.067±0.003) min，RSD為0.06%，峰面積為42.89±0.23，RSD為0.54%。

2.3.5Isoasp-DSIP對照品的測定 添加的isoAsp-DSIP對照品為4.805 μmol·L-1，測定的isoAsp含量結果為4.963 μmol·L-1(+3.3%)，符合測定結果在±10%范圍內的要求，表明本實驗檢測有效。

2.3.6重復性實驗 取30/70混合重組人胰島素注射液樣品(批號：3M12019065353)，照“2.2”項下方法平行制備6份，注入液相色譜儀，記錄，代入標準曲線計算，結果峰面積RSD為2.63%，isoAsp含量為(1.88±0.05) nmol·mL-1，RSD為2.44%。

2.3.7回收率實驗 取“2.2.1”項下樣品溶液15 μL與SAH(14.97 μmol·L-1)對照品各1，4，10 μL，加水至30 μL，混合均勻，制備低、中、高3種加標溶液各3份，分別置200 μL離心管中，照“2.2.2”項下進行實驗，測得的9份回收溶液SAH的量，計算加標回收率。低、中、高濃度加標回收率測定結果分別為114.0%,104.6%,97.29%，平均為105.3%，RSD為6.9%。表明實驗體系無干擾，保證實驗所得數據的準確度。

2.3.8檢出限 對照品SAH在進樣量5 pmol時，色譜峰的信號(S/N)為13.5，符合定量要求。

2.3.9樣品的測定 對不同廠家的樣品進行isoAsp含量進行測定，結果見表1。

表1 不同廠家的isoAsp含量Tab.1 The content of isoAsp in samples from different companies

3 討論

本研究先用胰蛋白酶將混合重組人胰島素注射液中的蛋白成分進行消化，產生分子結構更小的多肽片段，再利用PIMT(EC：2.1.1.77)的特異性作用，催化SAM上甲基轉移至isoAsp成為異天冬氨酸甲酯，SAM失去-CH3生成SAH，結合HPLC法，采用外標校正法檢測SAH的濃度，進而間接檢測isoAsp的濃度，建立混合重組人胰島素注射液中isoAsp的質量控制方法。

本研究對樣品消化時間(0.5，1 和2 h)、胰蛋白酶溶液配制溶劑(50 mmol·L-1醋酸-磷酸鉀緩沖液、50 mmol·L-1醋酸)進行考察，最后選擇緩沖液溶解的胰蛋白酶消化1 h處理樣品效果較好。

通常酶消化后的樣品采用磷酸終止反應，而本研究采取在-18 ℃立即冷凍停止反應。實驗中發現在下一步PIMT反應中，加入的磷酸使樣品溶液pH值較低，會影響PIMT酶的活性(PIMT酶在pH值6～8活性較高)，阻斷SAM與樣品中的isoAsp的反應。

《中華人民共和國藥典》2020年版三部收載A21脫氨胰島素[8]的測定方法。參考該方法測定各廠家樣品的A21脫氨胰島素含量，并將測定結果與isoAsp含量相比較，發現樣品中isoAsp測定結果較A21脫氨胰島素高，表明樣品中可能存在其他位點的脫酰胺化[9]。

利用胰蛋白酶消化樣品可能存在一定假陽性風險，LIU等[10]發現，在pH值 4.5條件下，Glu-C同樣可以有效地酶解樣品，且樣品在酶解過程中幾乎不發生新的脫酰胺化，從而使測得的脫酰胺水平更接近樣品中的真實值。isoAsp的產生是個動態變化的過程，建立準確定量的檢測方法[11-13]非常必要。