供體豬心在UW 液中的保存時間和溫度對其組織結構的影響

王翔宇，宋江平，舒松仁，任杰，鄭哲，胡盛壽，馬艷

心力衰竭被認為是現代社會的一種流行病，全球患病人數超過3 770 萬[1]，且隨著社會老齡化的進程以及基于循證醫學的治療方案的實施，慢性心力衰竭的患病率仍在不斷上升，許多患者進展到終末期心力衰竭，給全球經濟造成巨大負擔[2-4]。目前，心臟移植被認為是終末期心力衰竭患者的最佳選擇，在心臟移植50 多年的歷史中[5]，心肌保護液的發明和改進對于擴大移植心臟供體池、提高心臟移植手術成功率和患者術后的遠期存活率有重要意 義[6]。國際上常用的心肌保護液有HTK 液（histidine-tryptophan-ketoglutarate cardioplegia）、Celsior 液、UW 液（University of Wisconsin solution）。最近的一項Meta 分析表明，與Celsior 液相比，UW液保存可減少器官缺血性壞死；與HTK 液相比，用UW 液保存器官時，受體存活率更高[7]。在供體心臟的運輸過程中，心肌保護液的溫度和心臟的冷缺血時間是影響心臟結構和功能的重要因素。目前臨床上靜態低溫（4℃）保存是器官體外保存的常用方法，主要是因為低溫可以抑制細胞的生物化學活動，導致心臟對能量的需求降低[8]，從而盡可能延長心臟可以耐受的冷缺血時間[9]。但目前供體心臟可耐受的冷缺血時間仍然是限制移植心臟供體池容量的重要因素，冷缺血時間超過4 h 會顯著增加受體心臟移植后死亡率[10]。研究表明，亞常溫保存（如21℃，結合特制的心臟保存液）[11]以及過冷保存（使用特制保存液和制冷系統，低于0℃時仍然不凝固）[12]可有效延長供體心臟可耐受的冷缺血時間；但尚未有研究比較UW 液在傳統低溫保存、亞常溫保存及過冷保存條件下對供體心肌結構的影響。本研究試圖通過病理染色的方式，探究UW 液的不同保存溫度和外置時間對供體心臟結構的影響。

1 材料與方法

實驗動物：中華小型豬18 頭，8～17 月齡，體重26.50（25.80，27.65）kg，購自國家心血管病中心動物實驗中心。

實驗試劑及儀器：UW 液（ViaSpan,DuPont Pharmaceuticals，美國），全自動病理染色機（Thermo Fisher Scientific，美國），全自動數字玻片掃描系統（蔡司，德國）。

麻醉方法：參照Wei 等[13]發表的文獻，通過肌內注射由阿托品（0.05 mg/kg）、舒泰（3 mg/kg）、甲苯噻嗪（1.5 mg/kg）組成的混合物進行麻醉。通過耳緣靜脈放置22 G 靜脈導管，給予乳酸林格液以維持血容量，必要時靜脈注射異丙酚（2 mg/kg）。

供體豬心的獲取：根據現行的中國心臟移植供體心臟的獲取規范[14]，在豬達到良好的麻醉狀態后，由專業的心臟移植團隊按照下述流程開展供體豬心獲取：（1）消毒鋪巾；（2）切皮：使用電刀切皮，并根據供體狀態來補充血容量，必要時給予升壓藥物靜脈注射；（3）鋸胸骨：劈開胸骨后，將胸骨牽開器撐開，并在牽開器兩側各墊一塊打開的無菌治療巾，切開雙側胸膜；（4）阻斷：先阻斷上下腔靜脈，再阻斷升主動脈，然后立刻行肺靜脈及下腔靜脈切開減壓；負壓吸引溫血水，冰屑包裹心臟降溫；（5）灌注：用托馬斯液灌注，監測并記錄灌注壓力，同時用手感知主動脈根部和左心室，在保證充分灌注的同時避免左心室高張力，灌注至心臟完全停跳并觸摸柔軟；（6）切取供體心臟：心臟灌停后，向心包腔添加無菌冰屑以降溫；左手輕輕撩起心臟，以此離斷下腔靜脈和左右肺靜脈；游離至左心房頂及左右肺動脈水平時，將心臟放回心包腔，用冰屑心臟包裹以降溫；再游離弓近端和上腔靜脈，分別離斷后顯露左右肺動脈，將肺動脈離斷后沿組織間隙游離到左心房頂水平，最后將心臟大血管完整取下；（7）供體心臟檢查：將供體心臟置于裝滿冰屑的容器，檢查心臟有無損傷、結構異常及冠狀動脈病變等，然后用UW 液灌注，此時也要密切關注主動脈根部壓力情況，以保證左心室無異常充盈；（8）外科醫生更換無菌手套后，用3 000 ml 冰生理鹽水（0℃～4℃）沖洗心臟。

供體豬心在UW 液中的保存方法：在包裝袋內注入500 ml 的UW 液，將獲取的供體豬心分別放入包裝袋中，然后整體放入設置成不同溫度（21℃、4℃、-4℃）的冰箱中。根據存放的溫度以及供體豬心的外置時間，將取下的豬心保存在9 種條件下，分別為21℃、3 h，2℃、6 h，21℃、9 h，4℃、3 h，4℃、6 h，4℃、9 h，-4℃、3 h，-4℃、6 h，-4℃、9 h，每種保存條件下保存2 個豬心。

豬心心臟組織取材：在相應的溫度和時間下保存后，借鑒移植心臟標準化取材流程[15]，對豬心進行組織取材：（1）心臟稱重、拍照；（2）將心臟解剖為6 個部分：左心室前壁、左心室側壁、左心室后壁、室間隔、右心室前壁、右心室后壁；（3）測量主動脈瓣周徑、肺動脈瓣周徑、左心室室壁厚度、右心室室壁厚度、室間隔厚度；（4）石蠟病理標本的制備：在左心室前壁取一塊全層組織，并用10%福爾馬林保存。

病理組織切片制備：上述心肌組織經酒精梯度脫水后，包埋于石蠟中，用輪轉式石蠟切片機制作5 mm 厚的病理切片，置于載玻片上。

HE 染色及圖像分析：將恒溫攤片烤片機溫度設置成68℃，再將載玻片在其上放置45 min，之后在全自動機中進行HE 染色。

統計學方法：采用 SPSS 23.0 統計軟件進行統計分析，不符合正態分布的計量資料以中位數（P25，P75）表示。

2 結果

18 頭中華小型豬及其心臟基本特征：本研究共納入18 頭中華小型豬，編號為P1-P18，各豬的UW 液保存條件、月齡、體重及心臟質量見表1。豬心臟解剖實物圖見圖1。

表1 18 頭中華小型豬及其心臟基本特征

圖1 編號P13 中華小型豬心臟解剖實物圖

不同UW 液保存條件下中華小型豬心肌組織的HE 染色結果（圖2）：在21℃的UW 液中保存3 h 時，豬心心肌細胞即出現水腫（圖2 黑色箭頭），少量心肌細胞核溶解（即心肌細胞壞死，圖2 藍色箭頭），并伴有少量炎癥細胞浸潤（圖2 紅色箭頭），保存6 h時出現部分心肌細胞壞死，保存9 h 時發生大面積心肌細胞壞死。在4℃的UW 液中保存3 h 時，豬心心肌細胞出現少量炎癥細胞浸潤，保存6 h 時出現少量心肌纖維溶解（圖2 黃色箭頭），保存3 h 和6 h 時均未發現明顯的心肌細胞水腫和壞死，但保存9 h 時出現明顯的心肌細胞壞死。在-4℃的UW 液中保存3 h 時，豬心心肌細胞間的正常連接即被破壞，導致心肌細胞分離（圖2 白色箭頭），保存6 h 時出現明顯的心肌細胞壞死，保存9 h 時心肌壞死面積增大。

圖2 不同UW 液保存條件下中華小型豬心肌組織的HE 染色圖片（×40）

3 討論

供體心臟在移植前的保存過程中的缺血性損傷是影響移植后心臟功能和受體存活時間的重要因素，而心肌保護液的溫度以及供體心臟在保護液中的保存時間可影響缺血性損傷的程度[16]。

本實驗通過用3 種不同溫度的UW 液保存豬心，每種溫度下分別保存3 h、6 h、9 h，然后對豬心進行組織取材及病理染色。HE 染色結果顯示，在3種不同溫度下，豬心在保存過程中的缺血性損傷均隨著保存時間延長而加重，表現為心肌細胞水腫程度加深、心肌組織溶解和壞死面積變大。在21℃的UW 液中保存3 h 時，豬心心肌細胞即出現明顯的水腫，而在4℃和-4℃的UW 液中保存3 h 時，豬心心肌細胞并未出現水腫。這可能與21℃下心肌細胞的代謝水平較高有關，據文獻報道，溫度每升高10℃，心肌細胞的代謝水平約上升為原來的兩倍[17]，心肌細胞內三磷酸腺苷消耗加快，導致細胞膜鈉鉀泵的功能無法維持，造成細胞水腫。在4℃的UW液中保存6 h 時，豬心心肌細胞已經出現壞死，保存9 h 時壞死更加明顯。在-4℃的UW 液中保存 3 h 時，豬心心肌細胞間的距離已經增大，說明細胞之間的連接被破壞，這可能與低溫誘導的細胞膜損害以及組織內冰晶的形成有關[18-19]，而心肌細胞之間的分離將導致心肌細胞無法同時興奮和收縮[20]，極大地損害心臟功能。

本實驗還發現，在3 種不同溫度的UW 液中保存3 h 后，豬心心肌組織中即出現少量炎癥細胞，但是炎癥細胞數量并不多，且并未隨保存時間的延長而明顯增多，這可能與心臟離體后失去炎癥細胞的來源有關。后續研究可以將切除后的供體豬心在體外保存后，用受體豬的血來灌注供體心臟，或者將供體豬心移植到受體豬體內，適當時間后再取心臟組織進行病理學研究，有助于更科學地評估不同體外保存條件對心肌炎癥細胞以及缺血/再灌注損傷的影響。

本實驗結果對臨床供體心臟的保存有一定的指導意義。首先，由于在不同溫度下保存的供體心臟的缺血性損傷均隨著保存時間的延長而加重，所以在臨床工作中應盡量縮短供體心臟的體外保存時間。其次，保存溫度低于0℃會導致心肌組織內形成冰晶，進而損害供體心臟的結構和功能，故臨床工作中應避免0℃以下保存供體心臟。由于保存溫度升高會加快細胞代謝速率，進而縮短心臟可耐受的體外保存時間，故供體心臟在體外轉運過程中應保存于0℃以上的合適低溫范圍內。

本實驗證實，體外保存時間延長可加重供體心臟的缺血性損傷。21℃和-4℃的UW 液靜態保存均不利于心肌組織和細胞結構的維持。在4℃的UW液中靜態保存3 h 內，不會造成豬心明顯的心肌細胞壞死，但保存超過6 h 時則會對心肌細胞產生明顯的缺血性損害，故臨床工作中應盡量縮短供體心臟的體外轉運時間，并使之一直保存于0℃以上的合適低溫范圍內。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突