杜仲黃酮對2 型糖尿病小鼠胰腺凋亡因子的影響

范春惠，張琳惠，鄭 妮

（1.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院，杭州 310000；2.南方科技大學(xué)醫(yī)院，廣東 深圳 518000）

2 型糖尿病（T2DM）發(fā)病機制主要是前期的胰島素抵抗和后期的胰島細胞功能障礙或受損凋亡[1]。隨著T2DM 病程的發(fā)展，胰島細胞數(shù)量逐漸減少，胰島功能受損逐漸加劇，而胰腺細胞凋亡是其數(shù)量減少、胰島素分泌功能下降的主要因素之一[2]。杜仲黃酮是杜仲科植物杜仲（Eucommia ulmoidesOliver）的干燥樹皮中提取的主要成分。研究[3-4]表明，杜仲黃酮有良好的降糖、抗氧化應(yīng)激效果，本研究基于課題組前期研究（通過尾靜脈注射鏈脲佐菌素聯(lián)合高脂高糖飲食共同誘導(dǎo)構(gòu)建糖尿病小鼠模型）結(jié)果，探討杜仲黃酮對T2DM 小鼠胰腺凋亡因子的影響。

1 材料與方法

1.1 動物 雄性昆明小鼠，SPF 級，體質(zhì)量18～22 g，購自浙江大學(xué)實驗動物中心，合格證號：SCXK（浙）2019-0023。小鼠飼養(yǎng)于通風(fēng)良好環(huán)境，室溫18～25 ℃，相對濕度40%～70%，12 h 光照晝夜循環(huán)。實驗開始前小鼠進行適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周。

1.2 藥物及試劑 鹽酸二甲雙胍片（京豐制藥有限公司，批號：191115）；STZ（美國Sigma 公司，批號：B1863）；白介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、細胞凋亡因子Fas、可溶性細胞凋亡因子配體Fasl、C-肽、氧自由基（ROS）試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：20200918、20200925、20200927、20200908、20200911、20200906）；Bcl-2、Bax 一抗（英國Abcam 公司，批號：B2011、B2017）；杜仲黃酮提取：采用醇提取法提取杜仲黃酮。首先將干燥杜仲進行充分粉碎，粉碎藥材置于容器中采用70%乙醇（藥材:70%乙醇=1:15），在80 ℃條件下加熱回流提取2 h，連續(xù)提取3 次。將提取液進行過濾濃縮，獲得干燥杜仲黃酮提取物。

1.3 主要儀器 9602A-酶標(biāo)儀（北京艾普生物設(shè)備有限公司）；羅氏卓越型血糖儀（瑞士ACCU-CHEK Performa）；Mini-Protean Tetra 垂直電泳儀、轉(zhuǎn)膜顯影設(shè)備、GelDoc EZ 凝膠電泳成像分析系統(tǒng)（美國Bio-Rad 公司）。

1.4 方法

1.4.1 T2DM 小鼠模型建立 雄性小鼠禁食不禁水12 h，用4℃枸櫞酸緩沖液（pH=7.4）溶解的STZ 溶液，尾靜脈注射STZ（25 mg/kg）。注射后繼續(xù)予高脂高糖飼料喂養(yǎng)8 周，檢測小鼠空腹血糖（FBG），F(xiàn)BG ≥11.1 mmol/L 為T2DM 模型成功[5]。

1.4.2 分組及給藥 將造模成功的T2DM 模型小鼠隨機分為模型組、二甲雙胍組（32 mg/kg）、杜仲黃酮低劑量組（80 mg/kg）、杜仲黃酮高劑量組（160 mg/kg），每組10 只。另以健康昆明小鼠為空白對照組。各組予相對應(yīng)藥物灌胃60 d，每日1 次。模型組和正常對照組小鼠予等體積生理鹽水灌胃。

1.5 觀察指標(biāo) 末次給藥后，小鼠禁食不禁水12 h，測其FBG。切取部分胰腺組織，Tunel 染色觀察細胞凋亡情況。ELISA 法檢測血清中空腹C-肽含量以及胰腺中炎癥因子IL-6、TNF-α、跨膜蛋白Fas 及配體Fasl 含量。Western blot 檢測胰腺中促進細胞凋亡因子Bax 和抑制細胞凋亡因子Bcl-2 表達。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 18.0 進行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。多組間比較采用單因素方差分析，若方差齊性，采用Bonferroni法進行兩兩比較；若方差不齊，采用Kruska-Wallis H秩和檢驗；以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠給藥前后FBG 指標(biāo)變化比較 與空白組比較，模型組小鼠FBG 明顯升高（P＜0.05）。與模型組比較，二甲雙胍、杜仲黃酮組小鼠FBG 均降低（P＜0.05）。見表1。

表1 各組小鼠給藥前后FBG 指標(biāo)變化比較（，n =10）

表1 各組小鼠給藥前后FBG 指標(biāo)變化比較（，n =10）

注：與模型組比較，# P ＜0.05

2.2 各組小鼠胰腺組織細胞凋亡情況比較 與空白組比較，模型組小鼠胰腺有大量凋亡陽性細胞（P＜0.05）。與模型組比較，二甲雙胍、杜仲黃酮組小鼠胰腺凋亡陽性細胞較模型組少（P＜0.05）。見圖1。

圖1 各組小鼠胰腺組織細胞凋亡情況比較

2.3 各組小鼠胰腺中炎癥因子與跨膜蛋白及其配體含量比較 與空白組比較，模型組小鼠胰腺中炎癥因子IL-6、TNF-α 與跨膜蛋白Fas 及其配體Fasl 的含量增加（P＜0.05）。與模型組比較，二甲雙胍、杜仲黃酮組小鼠胰腺中IL-6、TNF-α、Fas、Fasl 含量減少（P＜0.05）。見表2。

表2 各組小鼠胰腺中炎癥因子與跨膜蛋白及其配體含量比較（，n =10）

表2 各組小鼠胰腺中炎癥因子與跨膜蛋白及其配體含量比較（，n =10）

注：與模型組比較，# P ＜0.05

2.4 各組小鼠胰島功能及胰腺中ROS 含量變化比較 與空白組比較，模型組小鼠血清中空腹C-肽含量減少，胰腺中ROS 含量增加（P＜0.05）。與模型組比較，二甲雙胍、杜仲黃酮組小鼠血清中空腹C-肽含量增加，胰腺中ROS 含量降低（P＜0.05）。見表3。

表3 各組小鼠胰島功能及胰腺中ROS 含量變化比較（，n =10）

表3 各組小鼠胰島功能及胰腺中ROS 含量變化比較（，n =10）

注：與模型組比較，# P ＜0.05

2.5 各組小鼠胰腺促凋亡因子Bax、抑凋亡因子Bcl-2表達比較 與空白組比較，模型組小鼠胰腺中促凋亡因子Bax 表達增加、抑凋亡因子Bcl-2 表達減少（P＜0.05）。與模型組比較，二甲雙胍、杜仲黃酮組小鼠胰腺中促凋亡因子Bax 表達減少、抑凋亡因子Bcl-2表達增加（P＜0.05）。見表4。

表4 各組小鼠胰腺促凋亡因子Bax、抑凋亡因子Bcl-2表達比較（，n =10）

表4 各組小鼠胰腺促凋亡因子Bax、抑凋亡因子Bcl-2表達比較（，n =10）

注：與模型組比較，# P ＜0.05

3 討論

胰島細胞是機體分泌胰島素，調(diào)控血糖的重要細胞器，其對各類應(yīng)激損傷、促凋亡刺激均極度敏感，而T2DM 的發(fā)病及病程發(fā)展與胰島細胞凋亡有關(guān)[6]。正常生理情況下，細胞凋亡是維持機體穩(wěn)定，清除損傷及多余細胞的有序性死亡。其凋亡路徑主要包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑、死亡受體介導(dǎo)的路徑、線粒體路徑、顆粒酶 B 途徑等[7]。在T2DM 的發(fā)病及病程發(fā)展中，胰島細胞凋亡的主要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑是線粒體路徑[8]。Bcl-2 蛋白家族中各個蛋白及其亞型與線粒體膜相結(jié)合，在凋亡的過程中起到不同的作用。

促凋亡因子Bax 和抑凋亡因子Bcl-2 是 Bcl-2 家族中重要的凋亡的因子。Bax 與Bcl-2 的比值間接反映了細胞受凋亡因子調(diào)節(jié)的程度[9]。T2DM 狀態(tài)下，Bcl-2與Bax 之間的表達平衡被破壞，胰腺細胞線粒體外膜的寡聚體轉(zhuǎn)化增多，孔模形成，線粒體外膜通透性增加，促使線粒體內(nèi)膜的細胞色素C 透過線粒體外膜上的孔模釋放到胞質(zhì)中[10]。線粒體內(nèi)部細胞色素C 的外排導(dǎo)致其內(nèi)部能量喪失，影響線粒體正常功能；細胞質(zhì)中過量的細胞色素C 與凋亡蛋白酶激活因子1、Caspase-9、ATP 形成凋亡體，激活跨膜蛋白Fas 與其受體Fasl 結(jié)合，活化Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7等凋亡因子，引起非蛋白溶解級聯(lián)反應(yīng)，使胰腺細胞解體而發(fā)生凋亡[11]。本研究結(jié)果表明，杜仲黃酮能降低糖尿病小鼠空腹血糖，減少胰腺組織中跨膜蛋白Fas配體Fasl 的含量，抑制凋亡因子Bcl-2 表達增加，促凋亡因子Bax 表達減少。

氧化應(yīng)激是 T2DM 發(fā)病及病程進展的關(guān)鍵因素，也是導(dǎo)致胰島細胞功能衰退及細胞凋亡的關(guān)鍵原因[12]。其通過多元醇通路、生物氧化和線粒體電子傳遞鏈等途徑增加機體內(nèi)的ROS 含量，造成胰腺細胞及蛋白和核酸等生物大分子損傷，細胞內(nèi)的線粒體結(jié)構(gòu)受損壞及功能出現(xiàn)障礙，直接或間接損傷胰腺β 細胞，使胰島細胞功能下降，加速其凋亡，影響胰島素分泌[13]。炎癥是胰島素抵抗與胰島β 細胞凋亡的重要橋梁。T2DM狀態(tài)下，胰腺β細胞內(nèi)炎癥相關(guān)信號通路被激活，促進各種炎癥因子TNF-α、IL-6 釋放，導(dǎo)致胰島素抵抗或胰島β 細胞凋亡[14-15]。本研究結(jié)果表明，杜仲黃酮能降低胰腺組織中ROS 及炎癥因子TNF-α、IL-6 的含量。

綜上所述，杜仲黃酮能增加血清中C-肽含量，減少胰腺中TNF-α、IL-6、ROS、Fas、Fasl含量及Bax表達，增加Bcl-2 表達，改善炎癥因子及氧化應(yīng)激對胰腺病理損傷，提高胰島功能，其作用機制與杜仲黃酮通過調(diào)節(jié)線粒體凋亡途徑中的相關(guān)凋亡因子及跨膜蛋白表達，減少胰腺細胞凋亡有關(guān)。