針康法對腦缺血大鼠缺血區BDNF、GFAP 和Caspase-3基因表達的影響

孔 妍，關睿騫，劉雙嶺

（黑龍江中醫藥大學附屬第二醫院，哈爾濱 150010）

腦缺血性腦血管病屬于中醫學的“中風”范疇，致殘性較高、治療周期偏長、預后多不良，約占腦血管病的70%以上，是臨床常見病、多發病，多見于老年人。在世界范圍內，腦缺血性腦血管病是導致殘疾、死亡等常見疾病，其高發病率已成為威脅整個人類健康的罪魁禍首[1-4]。流行病學研究表明，每年約有1 500 萬人遭受腦缺血性腦血管病的困擾，其中三分之一的患者喪生，另外三分之一的患者飽受身體殘疾和功能障礙的影響，給家庭和社會帶來巨大負擔[1]。尋找防治該病的方法對于改善患者生活質量、恢復運動功能、改善疾病不良預后具有重要意義。針康法是針灸療法和康復療法的有機結合。導師唐強教授基于頭穴叢刺治療腦血管疾病的明顯療效與腦可塑性理論，將傳統醫學中頭穴叢刺法與現代醫學中康復技術（Bobath 療法、PNF 法、運動再學習等）有機結合治療腦卒中后感覺、運動等功能障礙，獲得了滿意療效[5-8]。本研究旨在探究針康法對腦缺血大鼠缺血區BDNF、GFAP 和Caspase-3 基因表達的影響，以明確針康法治療腦血管疾病的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 雌性SD 大鼠50 只，清潔級，體質量220～240 g，由黑龍江中醫藥大學動物實驗中心提供。標準顆粒飼料喂養，周期照明，室內室溫20～25℃，相對濕度 40%～70%，實驗期間動物自由飲食和飲水。大鼠適應性喂養7 d 后，隨機分為空白組、模型組、針灸組、康復組和針康組，每組10 只。

1.1.2 儀器 多功能酶標儀（杭州奧盛儀器有限公司，型號：AMR-100）；試驗用電子秤（北京冀諾泰科技發展有限公司，型號：JNT-DC）；高精度凝膠成像系統（美國Bio-Rad 公司）；IBAS 2.5 全自動圖像分析系統（德國WKontron 公司）；6010 可見-紫外分光光度計（美國安捷倫上海分析儀器廠）；無菌EP 管（美國 Axygen 公司）；微量掌式離心機（德國WSIGMA 公司）；高速冷凍離心機（美國Beehman 公司）；-20℃冰箱（中國青島海爾電器有限公司）；超低溫-80℃冰箱（日本SANYO 公司）；電熱恒溫水浴鍋（中國上海比朗國際有限公司）；高壓滅菌器（德國BMT 有限公司）；高效微波爐（中國格蘭仕有限公司）；恒溫電熱恒溫干燥箱（德國梅爾特公司）；高效制冰機（美國Grant 公司）；大鼠專業跑臺（上海立泰生物科技有限公司）；Real-time PCR 系統（美國Applied Bio-Systems Instruments 公 司，型 號：ABI 7500）。

1.1.3 試劑 1% PMSF（苯基甲烷磺酰氟）（Beyotime公司，批號：ST505）；兔抗大鼠BDNF 單克隆抗體（武漢博士德公司，貨號：WH-4234）；兔抗大鼠Caspsae3 單克隆抗體(武漢博士德公司，貨號：WH-3234）；兔抗大鼠GFAP 多克隆抗體（武漢博士德公司，貨號：WH-3454）；山羊抗兔IgG 抗體（Bioker 公司，貨號：DD1500）；10%水合氯醛（北京六一試劑廠）；中性福爾馬林固定液（索萊寶科技有限公司，貨號：G2161）；RIPA組織裂解液（南京碧云天生物制劑公司，批號125-34）；TRIzol 試劑（美國Invitrogen 公司，批號：15596018）；逆轉錄試劑盒（美國Promega 公司，批號：A5000）；實時定量PCR 反應體系試劑盒（美國Promega 公司，批號：A6010）。

1.2 動物造模 本研究大鼠腦缺血模型參照Longa 改良線栓法，具體操作步驟如下：尼龍線栓子的制備，實驗用尼龍線直徑為0.20 mm，每段長500 mm，在解剖顯微鏡下將尼龍線頂端燒成直徑為0.25～0.30 mm的光滑圓球，在距頭端18.00 mm和22.00 mm處做標記，酒精清潔后置1:2 500 u 肝素生理鹽水中備用。模型制備方法：10%水合氯酵（300 mg/kg）腹腔注射麻醉后，將大鼠固定在實驗臺上，仰臥位取頸正中切口，切開皮膚，鈍性分離各層組織，分離右側頸總動脈（common carotid artery，CCA），向上分離右頸外動脈（external carotid artery，ECA）、頸內動脈（ICA），在近 CCA分叉處約 6 mm 處結扎ECA，于CCA 近心端夾上動脈夾，在ECA 近分叉處留置一打好結的絲線，勿收緊線結，在ECA 結扎處與分叉處之間做一直徑約0.20 mm的V 型切口，將尼龍線結扎切口處輕輕插入，輕輕收緊線結，松動脈夾，將尼龍線順MCA經ICA送入顏內，插入深度約19 mm，微遇阻力時停止，使尼龍線頭端位于MCA 起始處，附斷MCA 的血流。收緊絲線，海綿膠止血，縫合傷口，單籠飼養。空白組只進行麻醉和血管分離術，不結扎血管及導入線栓。

1.3 干預方法 空白組：假手術后不予任何處置，放回籠中安靜飼養。模型組：術后不予任何處置，放回籠中安靜飼養。針刺組：造模后24 h 給予頭穴從刺法，在相應的刺激區，用華佗牌針灸針（0.25 mm×25 mm）在取百會及百會左、右側各旁開4 mm 處向前平刺至頂前區，深度0.5 寸，其針刺區域覆蓋大鼠頂區和頂前區，針后捻轉1 min，頻率每分鐘200 轉，留針6 h，每2 h 捻轉1 次，每次15 min，每日1 次，共14 d。康復組：造模后24 h 給予跑臺訓練，每日25 min，每日1 次。跑臺參數設置如下，平板斜度設為零，履帶速度：術后第1～3 天為5 m/min；術后第4～14 天，10 m/min；第14 天及以后，15 m/min；每日1 次，共14 d。針康組：造模后24 h 給予針刺結合運動跑臺訓練。針刺操作方法同針灸組，康復操作方法同康復組，共14 d。

1.4 樣本采集 10%水合氯酸腹腔注射麻醉生效后仰臥固定，迅速打開胸腔，暴露心臟，將輸液器針頭從心尖部刺入左心室，剪右心耳，0.9%生理鹽水灌流，觀察大鼠的眼球和肺逐漸變白后，迅速完整地取出的腦組織作冠狀切面，自切面向頭側3 mm 左右作另一切面，取出的腦組織-80℃低溫冷藏備用，避免反復凍融。

1.5 檢測指標與檢測方法

1.5.1 qRT-PCR 檢測BDNF、GFAP 和Caspase-3 mRNA表達情況 取適量病變區腦組織，TRIzol 試劑提取腦組織樣品總RNA，6010 可見-紫外分光光度計檢測RNA 含量及質量，使用高效cDNA 逆轉錄試劑盒制備cDNA。冰上配制實時定量PCR 反應體系，qRT-PCR 在ABI 7500 實 時PCR 系 統 上 進 行。在前期研究基礎上，檢測如下指標：BDNF 上游GATCCACTGAGCAAAGCCGA，下游CTCACCTGGT GGAACATTGTG；GFAP 上游CCAAGCGGAGACAGA TCAAC，下游CCCAGGTCATTGGGGATCTT；Caspase-3 上游CGGCATGGGAGACAGATCAAC，下游CAACCAGGTCATGTGGATCTT；β-Actin F 上游ACGG TCAGGTCATCACTATC，下游TGCCACAGGATTCC ATACC。并使用2?ΔΔCt方法計算mRNA表達的相對定量。

1.5.2 Western blot 檢 測BDNF、GFAP 和Caspase-3 蛋白表達情況 從-80℃低溫冷藏冰箱取出腦組織，用1 mL 冰冷RIPA 組織裂解液，添加1% PMSF（苯基甲烷磺酰氟）、蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑制備腦總蛋白。液氮研磨，4 ℃，12 000 rpm 離心30 min，獲得蛋白上清。用BCA 法測定蛋白濃度。20 μg 蛋白在10% SDS-PAGE 凝膠上電泳，然后轉移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。在TBS-Tween 20 中用5%脫脂牛奶封閉后，4℃一抗下孵膜，如下：兔抗大鼠BDNF 單克隆抗體（1:1 000），兔抗大鼠Caspsae3 單克隆抗體（1:1 000），兔抗大鼠GFAP 多克隆抗體（1:1 000）。然后用TBS-Tween 20 洗滌3 次，每次15 min，再與二抗山羊抗兔IgG 抗體（Bioker，1:500）室溫孵育2 h。在最后的洗滌步驟后，對膜進行化學發光反應，并通過密度測定法計算個條帶灰度值（Quantity One 4.2，Bio-Rad，Hercules，CA），每個實驗至少進行3 次。利用Image Lab 軟件對各組蛋白灰度值進行檢測和量化。

2 結果

2.1 各組BDNF、GFAP 和Caspase-3 mRNA 表達水平情況比較 見表1。

表1 各組BDNF、GFAP 和Caspase-3 mRNA 表達水平情況比較（）

表1 各組BDNF、GFAP 和Caspase-3 mRNA 表達水平情況比較（）

注：與空白組比較，# P ＜0.05，## P ＜0.01；與模型組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01；與針灸組和康復組比較，▲P ＜0.05

結果表明，與空白組比較，模型組、針灸組、康復組和針康組BDNF 和GFAP mRNA 表達水平顯著增加，差異具有統計學意義；與模型組比較，針灸組、康復組和針康組BDNF 和GFAP mRNA 表達水平顯著增加，差異具有統計學意義；與針灸組和康復組比較，針康組BDNF 和GFAP mRNA 表達水平顯著增加，差異具有統計學意義。Caspase-3 的表達，與空白組比較，模型組、針灸組、康復組和針康組Caspase-3 mRNA 表達水平顯著增加，差異具有統計學意義；與模型組比較，針灸組、康復組和針康組Caspase-3 mRNA 表達水平顯著降低，差異具有統計學意義；與針灸組和康復組比較，針康組Caspase-3 mRNA 表達水平顯著降低，差異具有統計學意義。

2.2 各組BDNF 蛋白表達水平情況 見圖1。

圖1 各組BDNF 蛋白表達水平情況

結果表明，與空白組比較，模型組BDNF 蛋白表達顯著增加，差異具有統計學意義；與模型組比較，針灸組、康復組和針康組BDNF 蛋白表達顯著增加，差異具有統計學意義；與針灸組和康復組比較，針康組BDNF 蛋白表達顯著增加，差異具有統計學意義。結果提示，雖然單純針灸或單純康復療法可促進神經保護蛋白表達，但是針康療法能更好地保護缺血區受損的神經元，更利于神經元功能重建和肢體運動功能康復。

2.3 各組GFAP 蛋白表達水平情況 見圖2。

圖2 各組GFAP 蛋白表達水平情況

結果表明，與空白組比較，模型組GFAP 蛋白表達顯著增加，差異具有統計學意義；與模型組比較，針灸組、康復組和針康組GFAP 蛋白表達顯著增加，差異具有統計學意義；與針灸組和康復組比較，針康組GFAP 蛋白表達顯著增加，差異具有統計學意義。結果提示，雖然單純針灸或單純康復療法可促進神經修復功能增加，但是針康療法能更好地促進缺血區受損神經元的修復，促進神經元功能重建和肢體運動功能康復。

2.4 各組Caspase-3 蛋白表達水平情況 見圖3。

圖3 各組Caspase-3 蛋白表達水平情況

結果表明，與空白組比較，模型組Caspase-3 蛋白表達顯著增加，差異具有統計學意義；與模型組比較，針灸組、康復組和針康組Caspase-3 蛋白表達顯著增加，差異具有統計學意義；與針灸組和康復組比較，針康組Caspase-3 蛋白表達顯著增加，差異具有統計學意義。結果提示，雖然單純針灸或單純康復療法可抑制腦細胞凋亡，促進腦細胞存活，但是針康療法抑制腦細胞凋亡效果更顯著，更能有效促進腦細胞存活。

3 討論

腦缺血性腦血管病是臨床上導致患者高死亡率和致殘率常見疾病，發病誘因多樣，詳細發病機制未明[9-11]。腦缺血性腦血管病的發生發展與大動脈粥樣硬化，心源性栓塞，全身灌注不足，穿透性動脈疾病，頸動脈夾層，高凝性遺傳綜合征等諸多因素有關。研究[12]表明，缺血性腦病的發生率與種族等因素相關，與白種人相比，西班牙裔和黑人具有較高的患病風險。目前治療缺血性腦病的主要方法是及時有效地疏通阻塞的血管，溶栓、抗凝、介入等。然而，盡管有血運重建，缺血區血供改善，許多患者并不能達到良好預期的治療效果。同時，嚴格的溶栓治療時間窗（4.5 h內）限制了臨床應用。立足中醫經絡腧穴學理論，發揮針灸、推拿等學科優勢，探索有效的神經保護藥物及干預方法對治療缺血性腦病具有重要臨床意義[13-15]。

腦缺血性腦血管病又因其發病突然亦稱之為“卒中”，中醫學認為，其病機是由于素體虛弱或飲食不節，不忌肥甘，濕遏中焦而誘發，或者積勞成疾，正氣受損，又或者憂思甚罵，情志不遂，更傷中氣。臨床表現為突然昏仆，不省人事，或不經昏仆而以半身不遂，口舌歪斜，偏身麻木為主要癥狀，其證機多變，預后不佳。常伴隨他癥，如風之逆竄，故把此類病稱之為“中風”[16-17]。穴位針刺療法可以改善腦內血管、淋巴等循環系統，而且還可以改善大腦皮層生理電活動，屬于被動治療手段，它通過刺激經絡穴位，激活周圍和中樞神經系統中神經元的突觸，發揮易化作用，使因腦缺血而損傷的神經通路得以正常化，促進和改善中樞及周圍神經傳導功能的重組[18-19]。康復療法屬于主動再學習療法的一種，其原理可能系運動康復治療加速了腦缺血區側支循環的建立，促進了病灶周圍或健側腦組織的重建和代償，充分發揮了腦的“可塑性”[20-22]，具體表現為突觸的激活和“發芽”等，同時康復又可以抑制異常運動模式，促進正常運動模式的建立為目標，通過協調肌肉、韌帶、關節運動向中樞提供大量本體感覺輸入，發揮易化作用。針康法是針灸療法和康復療法的有機結合，二者相輔相成，改善了神經元代謝及信號傳導，同時又恢復了腧穴經絡斡旋之機，使陰陽和合、腧絡貫流。

BDNF 在中樞神經系統、周圍神經系統、內分泌系統骨和軟骨組織等，廣泛的區域內表達；BDNF 是腦內分布最廣泛的神經營養因子，BDNF 的神經營養作用非常廣泛，具有對神經細胞的保護作用，主作用包括能夠維持多類神經元存活并直接促進軸突生長，能夠通過促進突觸的可塑性促進樹突和軸突的長出[6]。本研究結果表明，腦缺血區BDNF 蛋白表達顯著增加，經過針灸治療、康復治療和針康治療后腦缺血區BDNF 蛋白表達更加顯著，尤其是針康療法BDNF 蛋白表達量最高，結果提示，針康法較單純針灸和單純康復療法療效更佳，能更好地保護缺血區受損神經元，促進神經元功能重建和肢體運動功能康復。GFAP 是成熟和反應性星型膠質細胞的特征性標記物，正常腦內GFAP 的表達與雖形膠質細胞數量的趨勢是一致的，病理上腦缺血區的GFAP 的表達增多，而且有一定的規律。而反應性AST 是對神經元損傷與修復的應答，修復損傷的神經元要通過物質交換、分泌生長因子、細胞因子、識別分子等途徑，促進受損的軸突的再生。本研究結果表明，腦缺血區GFAP蛋白表達顯著增加，經過針灸治療、康復治療和針康治療后腦缺血區GFAP 蛋白表達更加顯著，尤其是針康療法GFAP 蛋白表達量最高，結果提示，針康法較單純針灸和單純康復療法療效更佳，能更好地促進缺血區受損神經元的修復，促進神經元功能重建和肢體運動功能康復。Caspase-3 屬于白細胞介素 1β（interleukinconvertin ICE）轉換酶家族，是哺乳動物細胞凋亡的關鍵蛋白酶。細胞凋亡的發生是一個極其復雜的、由Caspase家族成員介導的蛋白酶級聯反應過程，Caspase-3處于調亡的核心位置，是決定細胞凋亡的“分子開關”，活化的Caspase-3 又進一步切割不同的底物，導致蛋白酶級聯切割放大，最終使細胞走向死亡。本研究表明，腦缺血區Caspase-3 蛋白表達顯著增加，提示腦細胞凋亡亢進，經過針灸治療、康復治療和針康治療后腦缺血區Caspase-3 蛋白表達更加降低，尤其是針康療法Caspase-3 蛋白表達量最低，結果提示，針康法較單純針灸和單純康復療法療效更佳，能更好地抑制缺血區受損神經元的凋亡，促進腦細胞存活，改善了肢體功能障礙，利于疾病向愈。

綜上，單純針灸或單純康復療法均可保護促進缺血區神經元并促進其修復功能，抑制神經細胞凋亡，促進腦細胞存活，針康療法能更好地促進缺血區受損神經元的保護和修復，能更好地抑制腦細胞凋亡，更利于促進神經元功能重建和肢體運動功能康復，這可能是針康法治療腦缺血性疾病，促進腦缺血神經恢復的部分機制。