推拿手法對缺血再灌注大鼠腦神經及自噬相關蛋白Beclin 1 表達的影響

蒙 蒙，胡冠宇，婁惠娟，張予心，王宇峰，叢德毓*

（1.長春中醫藥大學，長春 130117；2.南方醫科大學，廣州 510630；3.吉林省中醫院，長春 130021 ）

腦卒中是全球第二大死亡的主因，也是致殘的首要因素，在亞洲國家，腦卒中的發生情況正在逐年增加[1]，屬于中樞神經系統急性的腦血流循環障礙性疾病范疇，包括出血性和缺血性兩種，缺血性腦卒中是主要發病類型，占發病人群的85%左右，給患者的正常生活帶來了極大的挑戰與威脅[2]。腦缺血再灌注損傷是由于腦部的出血被阻斷，血液再次被灌流到 腦缺血的半暗部，從而進一步加重腦組織損傷程度，導致神經細胞發生損傷和壞死[3]。研究認為，細胞自噬發生在腦缺血再灌注階段，參與了腦神經組織與細胞的損傷和凋亡過程[4]，因此調節細胞自噬是醫治與預防腦缺血再灌注損傷的潛在治療靶點。現代醫學表明，推拿手法有增加局部血流量，促使受損神經細胞恢復的作用。本實驗以建立腦缺血再灌注動物模型為前提，以推拿手法作為干預手段，初步探討推拿手法調節自噬蛋白Beclin 1 的表達來影響腦卒中的治療，為臨床治療提供了豐富的科研數據支持。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF 級成年雄性Sprague-Dawley 大鼠共30 只，6～8 周齡，體質量（220±20）g，由長春市億斯實驗動物技術有限責任公司供貨[SCXK（吉）-2018-0007]。動物購回后，進食和攝水不受限制。持續性飼養1 周后造模。

1.2 造模方法 建立能模擬人的缺血性卒中再灌注大鼠（MCAO/R）模型[5]，適應性喂養1 周后，禁食不禁水12 h。在手術后1 d，采用Zealonga[6]評分的方法來篩選，得分在1～3 分后納入。

1.3 動物分組及干預

1.3.1 動物分組 按順序隨機抽取大鼠20 只，建立MCAO/R 模型。造模后平均隨機分為模型組和推拿組，推拿治療組為進行手法刺激，其他2 組僅作為觀察不做處理。

1.3.2 推拿手法治療 在造模成功后進行手法刺激，根據華興邦等編著的《實驗動物腧穴圖譜》來確定推拿組大鼠進行穴位操作的準確位置，選擇頭頂部百會、神庭，腿部足三里，點按法操作每次10 min，每日1 次。于每日上午9 點進行推拿手法刺激，連續治療，14 d后動物處死、取樣本。

1.4 觀察指標與檢測方法

1.4.1 行為學檢測 在造模1 d、3 d、7 d、14 d 后以ZeaLonga 評分法對大鼠神經功能進行評估。

1.4.2 TTC 測量 推拿后14 d，每組大鼠腹腔注射過量麻藥后，將腦組織快速取出，暫時冷凍后，連續5 次切成2 mm 后的腦片，TTC 染色后拍照，用Image J 圖像分析軟件來測量各組腦組織梗死體積占比分布情況。

1.4.3 TUNEL 染色 再灌注后14 d，取患側腦組織，根據TUNEL 染色試劑盒說明書加入染料，利用激光共聚焦顯微鏡拍取圖像，檢測腦神經凋亡的情況。

1.4.4 Western Blot、qPCR 檢測各組大鼠腦皮質的Beclin 1、Beclin 1mRNA 的表達情況 再灌注后14 d，冰下取鼠腦組織，凍于-80℃中，用以檢測Becliln 1 的蛋白及mRNA 含量。

1.5 統計學方法 數據分析應用SPSS 20.0進行統計，用均數±標準差（）表示計量資料，單因素方差分析用于2 組間的比較，治療前后的比較用t檢驗分析。

2 結果

2.1 各組間神經功能評分比較 見表1。推拿法治療可以有效改善病鼠腦卒中后的神經功能狀況。

表1 各組間神經功能評分比較（，n =10）

表1 各組間神經功能評分比較（，n =10）

注：與假手術組比較，# P ＜0.05；與模型組比較，△P ＜0.05

2.2 各組大鼠腦梗死情況評價 見表2，圖1 所示。圖中紅色部分顯示正常腦組織，蒼白的部位則為梗死區域；肉眼觀察假手術組沒有明顯梗死區域；模型組則有較大范圍的缺血性梗死灶，較模型組梗死灶體積來說，推拿組的梗死灶體積有明顯的減少。

表2 各組間腦梗死面積比較（）

表2 各組間腦梗死面積比較（）

注：與假手術組比較，# P ＜0.05；與模型組比較，△P ＜0.05

圖1 各組大鼠TTC 染色結果

2.3 TUNEL 法檢測神經細胞凋亡 在光學顯微鏡下來觀測各組大鼠腦組織的凋亡情況。如圖2 所示，治療14 d 后，存在大量凋亡細胞的為模型組，幾乎沒有陽性凋亡細胞的為假手術組，細胞凋亡數目明顯增多的為模型組；治療組的凋亡細胞較模型組有所降低。

圖2 各組大鼠TUNEL 染色結果

2.4 推拿治療對MCAO/R 大鼠腦組織中Beclin 1 蛋白表達的影響 見表3，圖3。結果顯示，治療14 d 后，推拿組的蛋白表達比另2 組有明顯升高。

表3 各組間Beclin 1 蛋白水平比較（，n =3）

表3 各組間Beclin 1 蛋白水平比較（，n =3）

注：與假手術組比較，# P ＜0.05；與模型組比較，△P ＜0.05

圖3 各組大鼠Beclin 1 蛋白水平比較

2.5 推拿治療對MCAO/R 大鼠腦組織中Beclin 1 mRNA 表達的影響 如表4。結果顯示，治療14 d 后，推拿組大鼠腦皮質Beclin 1 mRNA表達較模型組增加。

表4 各組間Beclin 1mRNA 比較（，n =6）

表4 各組間Beclin 1mRNA 比較（，n =6）

注：與模型組比較，△△ P ＜0.01

3 討論

腦卒中在中醫學中歸屬于“中風病”范疇，在《內經》中有較為詳盡的記載，古代醫家認為其病因病機可分為：“外風”“內風致病”“內傷外感同時致病”等理論，現代中醫認為中風是多因素綜合作用的結果，其發生多與所處的內外環境具有緊密的關系。但從總體上看，它屬于本虛標實。文獻記載，“陽脈之海”“病變于腦，首選督脈”，以往有學者也證實百會能減少腦梗死的體積和加強神經功能的評分，并在缺血性中風中發揮潛在的神經保護的治療作用[7]，并在治療神經系統疾病上發揮了重要的作用[8]，同時神庭與百會相配，可以起到促進睡眠的作用，從而幫助腦神經遞質的修復[9]。足三里可以起到增強體質的作用，同時運用點按法作用于各穴位，可加強氣血的運行，進一步加強身體的修復能力。因此本實驗基于“形神并重”的治療理念，采用“治神調形”的中醫治療原則，擇百會作為主穴，同時配伍神庭、足三里[10]。通過推拿按揉頭部百會、神庭，腿部足三里，達到行氣活血，通調經脈，補虛瀉實，陰陽協調的作用，從而加快中風的康復。有研究[11]證明，百會和足三里配合以JAK2/STAT3 為通路來對腦缺血的大鼠發揮神經保護的作用。

Beclin 1 是atg6 的哺乳動物同源物。Beclin 1 的翻譯后調控被干擾可能是調控自噬程度的一種途徑[12]。Beclin 1 不僅是調節自噬的關鍵因子，也可增強PI3K的活性。影響它的表達程度，對治療腦缺血的各種疾病有著重要的意義[13-16]。推拿手法在腦卒中的恢復過程中發揮了不可替代的作用，相對比康復技術來說，推拿手法的操作更簡便，不受時間和地點等條件限定。經過本實驗的研究表明腦缺血大鼠的神經損傷及梗死灶是可以通過及時進行推拿手法的干預來改善，根據蛋白檢測和熒光染色的結果發現推拿手法可以明顯增加大鼠腦內Beclin 1 蛋白及mRNA 含量的表達，從細胞自噬的角度說明了推拿手法可以增加自噬的表達，起到保護腦神經和預防腦卒中的作用，為臨床治療提供新的實驗數據支持，為進一步探索推拿手法通過各種通路影響自噬因子的表達奠定了基礎。

綜上所述，推拿手法可以調節Beclin 1 蛋白及mRNA 含量的表達，并改善腦細胞凋亡情況，從而起到對缺血性腦卒中的治療作用。