中草藥重要功能成分α-法尼烯檢測方法建立

鄭丹妮，陳思哲，吳芷玥，張一涵，崔 瑜，薛 闖，康 巍*

（1.大連理工大學生物工程學院，遼寧 大連 116024；2.大連理工大學寧波研究院，浙江 寧波 116038；3.石家莊第三醫院，石家莊 050011）

α-法尼烯（C15H24）是一種倍半萜烯[1]，多項研究表明其在多種中草藥，如姜黃[2-4]、陳皮[5]、江香薷[6]、檀香[7]發揮著重要功能。例如，姜黃具有抗腫瘤、抗氧化、降血糖等作用，其主要功效成分為酚酸類和萜烯類物質[3]，已有研究對姜黃的功能成分及主要藥理活性進行分析，結果表明姜黃揮發油中的倍半萜類物質可以起到抗氧化、抗感染的良好功效，其中的倍半萜主要為α-法尼烯[2]。α-法尼烯主要存在于水果表皮[8]。利用合成生物學方法在異源微生物細胞工廠中生產α-法尼烯具有安全、節能、綠色環保、產物純度高等優勢[9]。已有研究利用大腸桿菌[9]、畢赤酵母[10]實現α-法尼烯在異源微生物中的合成。

目前，α-法尼烯的主要檢測方法有固相萃取-比色法[11]、氣相色譜法[12-13]、高效液相色譜法[14]、氣相色譜質譜聯用法 [15]等。2011 年，Seon-Won Kim 團隊設計了一種人工合成α-法尼烯合酶的基因，但是該研究間接的用反式α-法尼烯為標準化合物對產物進行定量分析[16]。2021 年，江南大學石貴陽研究團隊采用高效液相色譜法（HPLC）對α-法尼烯進行定量分析[14]，但是α-法尼烯沸點為260 ℃，是一種具有揮發性的物質，因此基于GC-MS 的分析方法更適合用于分析該揮發性產物。然而，目前還缺乏一種快速、靈敏的基于GC-MS 的α-法尼烯檢測方法，特別是針對于成分復雜的細胞提取液中的法尼烯的檢測。

本研究選擇廣泛使用的大腸桿菌工程菌株作為細胞工廠，通過一種源自蘋果的α-法尼烯合酶（alphafarnesene synthase），利用E.coli 自身胞內代謝產物法尼基焦磷酸作為底物生產中草藥功能成分α-法尼烯；利用正十二烷對搖瓶發酵產物進行萃取，通過氣相色譜-質譜聯用法對細胞提取物進行分析，對α-法尼烯產量進行定量分析。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料 α-法尼烯合酶（aFS）基因來源于Malus domestica，經過大腸桿菌密碼子優化后，由金唯智合成。含His6 基因的pET28a 質粒來自實驗室保藏。

1.1.2 主要試劑 α-法尼烯標準化合物購自加拿大Toronto Research Chemicals；2YT 培養基，LB 培養基購于上海賽默飛世爾科技（中國）有限公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），卡那霉素（Kan）購于上海生工生物工程（上海）股份有限公司；用于DNA 片段純化及質粒提取試劑盒購于美國Omega 生物科技公司；蛋白質凝膠制備試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司；免疫印跡相關抗體來自美國abcam 公司。

1.1.3 主要儀器 PCR 儀購于德國Sensoquest 有限公司；蛋白質電泳及凝膠成像系統購于美國Bio-Rad 公司；NanoDrop One 用于定量DNA，蛋白質及OD600，氣相色譜質譜聯用儀用于檢測α-法尼烯生產于上海賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 質粒構建 將進行密碼子優化后的α-法尼烯合酶基因合成并通過同源重組的方法克隆到含有His6 的pET28a 載體。將連接產物轉化至大腸桿菌 DH5 感受態細胞中進行PCR 檢測，挑選陽性克隆菌株進行質粒抽提。

1.2.2 α-法尼烯合酶表達 將重組質粒轉化進入大腸桿菌Bl21（DE3）感受態細胞中，于含Kan 抗性（終濃度50 mg/L）的LB 固體培養基培養12～16 h，挑取單克隆菌落接種至5 mL含Kan抗性的2YT培養基，37 ℃培養12 h。取1 mL 活化菌液接種至100 mL 含Kan 抗性、3%（v/v）甘油的2YT 培養基中，在37 ℃下200 r/min 培養至OD600 達到0.6～0.8，添加終濃度0.1 mM IPTG 溶液調整至29 下誘導aFS 表達。誘導3 h 后，在培養基中加入5 mL 正十二烷覆蓋。誘導24 h后，取2 mL 油水混合物，經12 000 g 離心5 min，取上層有機相進行GC-MS 分析；取菌體用于十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），蛋白質免疫印跡（Western blotting）分析。

1.2.3 鑒定α-法尼烯合酶在大腸桿菌中的可溶性表達 取Bl21（DE3）空白菌體、未誘導和誘導后的表達菌體，誘導后菌體的破碎后沉淀及上清液，分別與SDS 上樣緩沖液混合，沸水浴5 min，進行SDS-PAGE電泳。通過使用對應的一抗、二抗識別，進行Western blotting 分析。

1.2.4 GC-MS 檢測α-法尼烯 采用氣相色譜-三重四極桿串聯質譜作為檢測儀器。按照表1 中GC-MS 分析條件進行測試。以正十二烷為溶劑，對α-法尼烯標準化合物進行梯度稀釋，建立標準濃度曲線，用于對aFS 催化產物進行定量分析。

表1 α-法尼烯GC-MS 分析條件

2 結果

2.1 α-法尼烯合酶的生物信息學分析 通過 NCBIBLAST 程序對 α-法尼烯合酶的氨基酸序列進行對比，并用pymol 對其空間結構進行分析，相關位點如圖1。

圖1 α-法尼烯合酶的序列和結構分析

2.2 質粒構建 通過特異性引物，運用PCR 技術得到aFS 片段和含His6 的pET28a 片段。將其進行同源重組，轉化后，使用通用引物進行PCR 檢測，如圖2 經瓊脂糖電泳檢測在2 000 bp 附近有特異性條帶，分子大小于理論值相一致。將抽提的陽性質粒進行測序，序列與基因庫序列一致。以上結果表明重組pET28a-aFS 質粒構建成功。

圖2 核酸電泳圖

2.3 酶的表達 將重組質粒pET28a-aFS 質粒導入大腸桿菌BL21（DE3）菌株，在29 ℃經IPTG 誘導。經10%的SDS-PAGE 分析，可見大小約為80 kD 的目標條帶。融合蛋白可以與Anti-His6 抗體特異性結合，并用對應二抗進行識別，結果如圖3 表明該蛋白成功表達，并部分存在于裂解上清液中。

圖3 Western-blot 驗證

2.4 GC-MS 檢測

2.4.1 GC-MS 可檢測到α-法尼烯標品 以正十二烷為溶劑配制濃度為0.05、0.1、0.5、1、2.5、5、10、25、50、100 mg/L 的α-法尼烯標準品，按照上述色譜條件進行試驗，氣相色譜結果如圖4，可見α-法尼烯出峰位置為9.21 min。α-法尼烯標準濃度曲線，如圖5。

圖4 α-法尼烯標準品的GC-MS 峰圖

圖5 α-法尼烯標準濃度曲線

2.4.2 GC-MS 分析大腸桿菌萃取液中的產物 將大腸桿菌發酵液進行離心，取上層正十二烷提取液，按上述檢測條件進行GC-MS 分析，由色譜結果（如圖6）可知在萃取液檢測到有α-法尼烯的生產。

圖6 大腸桿菌發酵提取液的GC-MS 峰圖

本研究建立直接、快速、靈敏、微量的 α-法尼烯檢測方法，并通過大腸桿菌對 α-法尼烯合酶進行過表達，檢測到該酶的可溶性表達，并通過氣質聯用對其催化產物 α-法尼烯進行定量分析，對其功能進行驗證。

3 討論

α-法尼烯是多種中草藥中的重要有效成分，多項研究表明其具有抗炎、抗氧化活性。利用生物合成法生產法尼烯具有低碳、綠色、環保、產率高的特點。本研究的結果表明，通過在大腸桿菌中構建代謝通路可以大量獲得α-法尼烯，產量達到3.63 mg/L 。基于之前研究，大部分實驗團隊選擇以反式β-法尼烯作為標品，存在檢測復雜，步驟繁瑣等問題。本研究成功在大腸桿菌中表達了α-法尼烯合酶，以大腸桿菌中MEP 途徑的代謝產物FPP 為底物實現了 α-法尼烯的合成，并完成 α-法尼烯的微量定量，產物的提取和定量分析。該研究為進一步闡明α-法尼烯在多種中草藥中的功能，拓展α-法尼烯在疾病治療中的應用場景奠定了堅實基礎。