結核分枝桿菌PknG抑制內毒素介導的巨噬細胞炎癥免疫應答

彭章麗 沈瑤 付雪峰

遵義醫科大學附屬醫院呼吸與危重癥醫學科結核病區（貴州遵義563000）

結核病是由結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）感染引起的慢性傳染病，嚴重威脅著人類健康。據2019年WHO報道，截至2018年，全球結核病患者達1 000 萬左右，中國是全球30 個結核病高負擔國家之一，結核病發病率及耐藥結核病發病率居全球第二，給我國人民的健康帶來嚴重威脅［1］。Mtb 是一種典型的胞內病原體，主要通過呼吸道進入人體。吸入的Mtb 遭遇宿主免疫防御系統的攻擊，Mtb 被肺部巨噬細胞吞噬，進一步引起T 細胞、B 細胞聚集形成肉芽腫，研究表明在活動性結核病及結核分枝桿菌潛伏感染病中，肉芽腫的形成、數量及形態學上都存在很大差異［2-4］。越來越多的證據表明，促炎免疫應答能夠有效控制Mtb 感染，抑制免疫應答能促進Mtb 在巨噬細胞內的存活，從而有效逃逸巨噬細胞對Mtb的攻擊［5］。Mtb 與宿主之間通過復雜的免疫調節作用維持免疫平衡狀態，能夠有效清除Mtb，部分Mtb 效應蛋白會抑制該過程的發生［6］。目前越來越多的研究報道，Mtb 相關基因參與調控Mtb 感染宿主細胞的免疫調節作用。同時，Mtb 感染巨噬細胞后釋放大量的促炎細胞因子，如TNF-α、IL-6 及IL-1β［7-8］，但Mtb 哪些效應分子參與了該過程的調節作用及機制有待進一步研究。

真核樣絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（STPKs）是與信號識別和適應性反應相關的調節元件，Mtb 編碼11 種從PknA 到PknK 的真核源性的STPK，它們參與多種細胞過程，包括細胞形態，葡萄糖和谷氨酰胺轉運，吞噬體-溶酶體融合以及轉錄因子的表達或活性。其中PknG 及PknH 與真核絲氨酸/蘇氨酸家族蛋白同源性更高。Mtb PknG 由Mtb Rv0410c基因編碼，包括與分枝桿菌細胞成分結合的胞外谷氨酸結合段，因此，PknG 能夠提呈谷氨酰胺。研究表明PknG 能夠促進分枝桿菌在巨噬細胞內的存活［9］。進一步研究結果表明PknG 通過Rab7l1抑制吞噬溶酶體的融合促進分枝桿菌在巨噬細胞的存活［10］。SecA2 依賴性蛋白輸出系統在Mtb 抑制吞噬溶酶體的融合過程中扮演著重要的角色，其中SapM 和PknG 是通過SecA2 途徑輸出的兩種關鍵效應子［11］。研究表明SapM 也可以通過抑制NF-κB 及MAPKs 調節細胞因子的改變調節分枝桿菌在巨噬細胞內的存活［11］。Mtb 感染巨噬細胞的過程中，PknG 抑制吞噬溶酶體的融合從而促進Mtb 在巨噬細胞內的存活，作為同樣分泌效應的SapM 分子能通過抑制吞噬溶酶體的融合及抑制炎癥細胞因子的表達共同促進Mtb 在巨噬細胞內的存活。由此提出假設，Mtb PknG 蛋白是否能抑制感染巨噬細胞炎癥細胞因子的表達。

脂多糖（LPS）誘導巨噬細胞反應性氧化分子（ROS）的產生，然后激活NF-κB 信號通路。既往研究表明結核分枝桿菌RD-1區域主要分子CFP-10及ESAT-6 分子通過抑制LPS 誘導的炎癥細胞因子發揮作用。有研究認為脂多糖LPS 是TLRs 受體的分子配體，能夠激活細胞的炎性反應，促進IL-6、IL-1β、TNF-α 等炎性細胞因子的分泌，在結核分枝桿菌感染過程中可通過TLR4 受體結合促進炎癥免疫應答釋放大量驗證細胞因子。因此，本研究通過構建PknG-pET28a 同源重組質粒，經IPTG 誘導表達，鎳柱及不同濃度咪唑純化及透析結核分枝桿菌PknG 蛋白，western blot 驗證PknG 蛋白，最終通過TLR4受體激動劑LPS刺激巨噬細胞，檢測LPS激活炎癥免疫應答，PknG 處理后，用LPS 處理巨噬細胞不同時間點，然后檢測相關炎癥細胞因子的表達，為進一步了解結核分枝桿菌分泌蛋白PknG 抑制巨噬細胞炎癥細胞因子的表達提供一些理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑DNA 聚合酶，限制性內切酶和T4 DNA 連接酶均購自TAKARA（日本）。引物，寡核苷酸，質粒提取試劑盒和凝膠提取試劑盒購自Sangon Biotech（China）。Pfu UltralI Fusion HSDNA Polymerase 高保真酶購自Stratagene 公司，DNA 膠回收和質粒小提試劑盒購自Qiagen 公司，Trans 2K plus、DH5α 感受態細胞購自北京全式金公司，EcoR I、XhoI 等限制性內切酶及購于Takara 公司，PageRuler 購自Thermo 公司。細胞裂解液、PMSF購自碧云天公司，Commas-R250 上海生工，超靈敏ECL 化學發光試劑盒購自上海天能公司，辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗鼠抗體購自proteintech 公司。

1.2 構建Mtb PknG-pET28a 原核表達質粒以Mtb H37Rv 基因組為模板，利用引物PknG-F 及PknG-R 擴增Mtb 目的基因PknG。利用EcoR I 和Xhol I 酶切回收擴增產物和載體pET-28a，連接酶切片段，轉化DH5α 感受態細胞，選單克隆點進行PCR 及DNA 測序驗證，將質粒轉化到BL21 感受態細胞中。

1.3 重組蛋白的表達純化

1.3.1 重組蛋白的誘導表達優化表達條件，在20 mL 的Luria Bertani（LB）培養基中進行了PknG的小規模誘導表達。用不同濃度IPTG（0.1、0.5、1.0 mmol/L）和誘導溫度（16、25、37 ℃）進行誘導表達。然后大規模誘導表達PknG，重組菌株在含有卡那霉素的LB 培養基中于37 ℃，250 r/min 振蕩生長6 h，直至OD600 達到0.6 至1.0 之間，1 mmol/L 的IPTG 16 ℃誘導，250 r/min 振蕩培養16 h，分別收集誘導前及誘導后菌體沉淀，用于后期驗證，驗證表達成功后，將上述誘導后的菌液于4 ℃下250 r/min振蕩2 h，將離心管放于-80 ℃凍30 min，37 ℃融化30 min，反復凍融3 次，加入DNase（100 μg/mL）（1∶500），4 ℃靜置30 min，通過在冰上以200 W 的功率使用5 s on/5 s off 超聲波處理細菌30 min 以裂解。4 ℃12 000 r/min 30 min分離上清液和沉淀。取出100 μL 上清液備用，挑取少許沉淀加PBS 重懸；再加入5×loading buffer，將上清及沉淀進行SDS-PAGE分析蛋白。western blot 檢測帶有His 標簽的PknG蛋白的表達。SDS-PAGE分析時，將SDSPAGE 膠放入考馬斯亮藍R-250 染液中染色5 h 以上，然后脫色，觀察膠圖，確定蛋白是否表達。

1.3.2 重組蛋白的純化將具有親和標簽的重組蛋白按照標準的Ni-親和純化程序進行純化。SDSPAGE 確定蛋白在上清后，用0.45 μm 的無菌過濾嘴過濾。將過濾后的蛋白質液與已經用裂解緩沖液平衡過的His-Ni-NTA 親和柱上（Thermo Fisher Scientific，USA）充分混合，吸回離心管中，4 ℃過夜；用1×bind buffer 清洗柱子3 次，將過夜后的蛋白鎳混合液再次上柱，以增加蛋白的回收量。用1×bind buffer 清洗柱子3 次，接取蛋白液標記為FT1；依次用50、100、200 mmol/L 的咪唑清洗柱子3次，分別接蛋白液標記好；然后用Strip buffer終止，標記為Strip；將每個濃度挑取第一個及最后一個用于SDS-PAGE 膠，然后考馬斯亮藍染色。用分子量小于目標蛋白大小的濃縮管過濾，經12 000 r/min離心30 min，剩下的即是目標蛋白PknG。

1.4 結核分枝桿菌PknG 蛋白與RAW264.7 細胞相互作用

1.4.1 重組PknG 蛋白對巨噬細胞的作用6 孔板中巨噬細胞5×105個/mL，置于37 ℃，5%CO2培養箱中培養12 h 后換入新鮮的培養液。實驗分為三組：第一組用10、50、100 μg/mL 的重組PknG 蛋白預處理巨噬細胞2 h；第二組：用10、50、100 μg/mL的重組PknG 蛋白預處理巨噬細胞2 h，然后予100 ng/mL LPS 處理0、12 和24 h；第三組中只加入100 ng/mL LPS 作用于巨噬細胞0、12 和24 h。于不同時間點收集細胞上清，用于ELISA 檢測；1×PBS洗細胞3 遍，用Trizol 裂解細胞用于后續實驗。

1.4.2 熒光定量PCR 檢測炎性細胞因子的mRNA水平表達量本實驗采用熒光定量PCR 技術，檢測LPS 誘導細胞后PknG 蛋白對炎癥細胞因子mRNA 的表達水平。將上述步驟1.4.1 收集的細胞裂解液，按照RNA 提取試劑盒提取細胞總RNA，經反轉錄后，熒光定量檢測炎性因子TNF-α、IL-6 mRNA 表達量。

1.4.3 ELISA 檢測炎性細胞因子的蛋白表達水平將1.4.1 中收集的上清液，按照ELISA 相關步驟檢測TNF-α、IL-6 的蛋白表達水平。

1.5 統計學方法采用Graphped prism 6.0 軟件進行統計學分析，數據以均數±標準差表示，比較采用方差分析。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 成功表達PknG 蛋白Mtb 進入機體后，通過一系列的免疫防御機制抵御宿主免疫系統的攻擊，Mtb 相關基因參與結核分枝桿菌的感染過程，通過原核表達相關蛋白進一步探討Mtb PknG 的作用及其機制研究。在NCBI 上查詢獲得PknG 全基因序列，通過構建PknG-pET28a 融合表達質粒，進一步表達及純化Mtb PknG 蛋白。將PknG-pET28a重組質粒轉化至E.coli BL21 表達株中，通過優化表達條件，最終在16 ℃條件下誘導獲得PknG蛋白，通過鎳柱純化、咪唑洗脫及透析獲取純化的PknG 蛋白，測定濃度后保存于-80 ℃。考馬斯亮藍染色驗證IPTG 誘導濃度（圖1A），SDS-PAGE 驗證純化后的PknG 蛋白（圖1B），western blot（圖1C）結果表明成功表達及純化Mtb PknG 蛋白。

圖1 表達結核分枝桿菌PknG 蛋白Fig.1 Purification the Mycobacterium tuberculosis PknG protein

2.2 PknG 蛋白抑制LPS 誘導炎性細胞因子的表達用PknG 蛋白預處理巨噬細胞后用LPS 作用于巨噬細胞，Real-time PCR 及ELISA 結果表明PknG明顯抑制炎癥細胞因子TNF-α 及IL-6 的mRNA 及蛋白質表達（圖2）。

圖2 PknG 抑制炎癥細胞因子TNF-a 及IL-6 的表達Fig.2 PknG inhibited the expression of TNF-a and IL-6

3 討論

Mtb 是胞內病原菌，已與人類共同進化數千年，越來越多的證據表明，宿主-病原體相互作用促進了Mtb 與其宿主的共同進化［12-14］。在這個過程中，Mtb 可以通過各種途徑來操縱巨噬細胞活化并在巨噬細胞內建立適當的增殖環境以防止消除［12-14］。宿主細胞通過肉芽腫形成一個相對無菌狀態，維持機體與病原體的相對平衡。相反，病原體通過一系列的機制逃逸宿主免疫系統的攻擊，通過影響宿主細胞一系列的信號通路促進Mtb 在巨噬細胞內的存活，達到與宿主細胞共存，如抑制抗菌肽的產生、阻止吞噬溶酶體的成熟、抑制巨噬細胞的凋亡、抑制炎癥的激活，促進巨噬細胞的自噬，這些機制同樣也限制了Mtb 感染中的適應性免疫應答的激活［12-14］。因此，Mtb 許多毒力因子都參與到抵御巨噬細胞免疫攻擊的相互作用中，Mtb STPKs 是與信號識別和適應性反應相關的調節元件，本研究進一步闡明Mtb PknG 在LPS 誘導的巨噬細胞炎癥免疫應答中的作用。

Mtb 相關毒力分子參與炎癥免疫應答，從而調控Mtb 在巨噬細胞內發揮的免疫逃逸作用，且病原體在感染的早期可以對宿主的免疫系統進行調控，這對病原成功建立感染和長期的潛伏感染非常重要，KHAN 等［15］的研究認為PknG 與結核分枝桿菌潛伏感染有關。研究證明，諸如TNF-α、IL-1β和IL-12 等免疫調節分子是宿主抵抗Mtb 感染的免疫防御系統的重要組成部分［11］。因此，進一步研究Mtb PknG 的相關作用尤為重要。本研究成功純化結核分枝桿菌PknG 蛋白為研究結核分枝桿菌相關分子在結核病診斷及治療中奠定基礎。馮金棟等［16］也通過蛋白純化的方式表達及純化結核分枝桿菌Rv2041c 蛋白，并進一步了解該蛋白在結核病診斷中的作用。另外，本研究發現PknG 蛋白預處理巨噬細胞后，LPS 作用于巨噬細胞，PknG 蛋白能明顯抑制LPS 所致的炎癥免疫應答，抑制細胞因子TNF-α 及IL-6 的產生，且對TNF-α 的抑制效果明顯強于IL-6，據相關文獻報道TNF-α 及IL-6 的產生與結核分枝桿菌毒力之間存在明顯的負相關［17-18］，說明PknG 蛋白可能作為毒力分子參與結核分枝桿菌的感染過程，與既往研究一致［9，19-21］。SWAIN 等［22］的研究認為PknG 可作為抑制劑抑制結核分枝桿菌ATP 靶點，從而調整結核分枝桿菌在巨噬細胞內存活；SONG 等［23］研究認為PknG 可作為泛素連接酶調控結核分枝桿菌感染巨噬細胞的免疫應答；既往研究認為結核分枝桿菌PknG 可通過影響吞噬溶酶體融合［9］、自噬［21］及炎癥免疫應答促進結核分枝桿菌在巨噬細胞內的存活。其他的研究結果表明Mtb 相關蛋白可發揮類似PknG的抑制免疫應答的作用，HA 等［24］研究認為Mtb 分泌蛋白ESAT-6 通過NF-κB 及MAPKs 信號通路抑制LPS 誘導的巨噬細胞炎癥免疫應答，可參與Mtb免疫逃逸機制。

膿毒血癥是一種由全身過度炎癥引起的疾病，由于過度產生促炎因子而引起。AHMED 等［25］研究認為Mtb PPE18 蛋白能夠抑制LPS 誘導小鼠感染模型中的炎癥細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6 及IL-12 的產生，可作為控制膿毒血癥的一個潛在治療靶點。本研究中表達純化的PknG 蛋白能夠明顯抑制LPS 產生的炎癥細胞因子的表達，尤其影響TNF-α 的產生，且LPS 作為TLR4 受體的激動劑，由此推測結核分枝桿菌PknG 是否通過TLR4信號通路影響炎癥細胞因子的表達需進一步深入研究。關于Mtb PknG 是否通過調控Mtb 炎癥免疫應答機制促進Mtb 在巨噬細胞內的存活，有待進一步研究。

綜上所述，本研究通過體外表達及純化Mtb PknG蛋白抑制了LPS介導的炎癥細胞因子TNF-α，IL-6 的表達，可能作為在結核分枝桿菌感染合并膿毒血癥過程中治療的一個潛在靶點。