EIF4A3結合并穩定基質金屬蛋白酶11促進結直腸癌侵襲遷移和上皮間質轉化進程

韓思靜 賀丹 李昌平

1西南醫科大學（四川瀘州646000）；2成都醫學院第二附屬醫院·核工業四一六醫院（成都610000）；3西南醫科大學附屬醫院（四川瀘州646000）

結直腸癌現已成為全球第四高病死率的癌癥，遺傳、飲食習慣、肥胖、吸煙等多種因素都與結直腸癌的發生密切相關［1］。結直腸癌的治療方案主要以手術切除聯合化療為主，隨著醫學技術的進步，局部手術治療、靶向療法和免疫治療也為患者帶來了新的福音，大幅提高結直腸癌晚期患者的總生存期。但即便如此，由于結直腸癌發生機制不明確、診斷不及時等原因導致結直腸癌的治療形勢依舊十分嚴峻。

基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）介導基質結締組織和基底膜成分的降解，在腫瘤的侵襲、轉移及上皮間質轉化（epithelialmesenchymal transition，EMT）過程中發揮重要作用［2-5］。MMP11 是MMP 家族蛋白的一員，有研究報道MMP11 在胃癌［6］、乳腺癌［3］、結直腸癌［7］、膀胱癌［8］、卵巢癌［9］中高表達，并且在胃癌研究中發現敲除MMP11 能夠抑制胃癌細胞的增殖和侵襲［10］。這些研究都表明MMP11 在癌癥中作為促癌因子發揮作用，故MMP11 具有作為癌癥治療靶點的潛力。但是MMP11 在結直腸癌中的研究主要集中在MMP11 與結直腸癌患者預后、臨床特征之間的相關性上［7］。因此需要深入研究MMP11 在結直腸癌中的調控機制，為結直腸癌的靶向治療提供新的策略和思路。

1 材料和方法

1.1 試劑及材料DMEM 培養基、RPMI-1640 培養基、胎牛血清（FBS）、TRIzolRNA 分離試劑、全蛋白裂解液、逆轉錄試劑盒以及SYBRGreen 試劑盒均購自Thermo Fisher Scientific（中國）；放線菌素D購自范德（北京）生物科技有限責任公司；MMP11兔多抗、EIF4A3 兔單抗、Vimentin 兔單抗、N-cadherin 兔單抗、E-cadherin 兔單抗、GAPDH 兔單抗以及辣根過氧化物酶（HRP）標記的IgG 二抗均購自Abcam。

1.2 細胞系和組織正常人結腸上皮細胞（FHC）和人結直腸癌細胞（SW480、HCT15、DLD1 和SW620）均購自中國科學院細胞庫，由本實驗室傳代保種。將FHC、SW480、SW620 置于含10%胎牛血清（FBS）的DMEM 培養基中，HCT15、DLD1 在含10%FBS 的RPMI-1640 培養基中在37 ℃、5% CO2，無菌恒溫培養箱中培養。

獲取成都醫學院第二附屬醫院核工業四一六醫院2019年4～8月進行手術切除的20 例結直腸癌患者癌組織及癌旁組織（其中男10 例，女10 例，T1-T2 期樣本1 例，T3-T4 期樣本19 例，6 例不存在淋巴結轉移，14 例存在淋巴結轉移，11 例不存在遠處轉移，9 例存在遠處轉移），組織采集后立馬保存在液氮中。組織采集已征得患者和家屬知情同意，并報告醫院倫理委員會審批通過。

1.3 方法

1.3.1 生物信息數據庫分析UALCAN 數據庫（http：//ualcan.path.uab.edu/index.html）是一個可用于分析癌癥組學數據的網站，通過UALCAN 數據庫查詢結直腸癌患者中TOP25 高表達基因，和MMP11 在結腸腺癌（colon adenocarcinoma，COAD）患者中的表達水平。GEPIA2（http：//gepia2.cancerpku.cn/#index）是一個基于TCGA 和GTEx 項目人癌癥基因表達譜的數據庫，通過GEPIA2 數據庫查詢MMP11 在結直腸癌中的表達水平。ENCORI（http：//starbase.sysu.edu.cn/panCancer.php）是 一 個大型包含miRNA-lncRNA、miRNA-mRNA、RBPRNA 和RNA-RNA 相互作用的在線網站，并包含了mRNA 和miRNA 在癌癥中表達水平及相關性的數據庫，通過ENCORI 查詢MMP11 在結直腸癌中的表達水平及MMP11 mRNA 能和真核翻譯起始因子4A3（EIF4A3）蛋白結合可能性。

1.3.2 細胞轉染與分組從上海生工購買si-EIF4A3、pEGFP1 載體構建pEGFP1-EIF4A3 和pEGFP1-MMP11 重組質粒及其陰性對照。將HCT15 細胞隨機分成陰性對照組、EIF4A3抑制組、EIF4A3過表達對照組、EIF4A3 過表達組、EIF4A3 抑制+MMP11 過表達對照組和EIF4A3 抑制+MMP11 過表達組。轉染前一晚將0.8 × 106個細胞接種在35 mm 培養皿中，等細胞到達對數生長期時，根據參考說明書使用LipofectamineTM3000（Invitrogen 公司，美國）向各處理組細胞轉染對應的siRNA、重組載體和對照。

1.3.3 mRNA 半衰期測定將si-EIF4A3 及其陰性對照分別轉染到HCT15 和DLD1 細胞中，24 h 后加入10 μg/mL 的放線菌素D，并在0、3、6、9、12 h 后提取細胞中總RNA，檢測MMP11 mRNA的表達量。

1.3.4 RNA 結合蛋白免疫沉淀（RIP）將各組細胞用預冷的IP buffer 裂解液在冰上裂解30 min 后，4 ℃，12 000 rpm 離心15 min 后，取上清液分裝在兩個離心管中，加入Protein A/G 4 ℃孵育過夜。離心取上清，分別加入EIF4A3 和IgG 抗體4 ℃孵育1 h后，再加入預處理好的Protein A/G 4 ℃孵育過夜，離心后棄去上清。加入IP buffer 裂解液洗滌3 次，Trizol提取總RNA，檢測MMP11相對表達量。

1.3.5 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）使用Trizol（Invitrogen）按照制造商的方案從細胞中提取總RNA。使用反轉錄系統試劑盒（Invitrogen）合成cDNA。按照制造商的方案使用miScript SYBR Green PCR Kit（Qiagen，Germany）進行qRT-PCR。以GAPDH 為內參進行歸一化處理，結果用2-ΔΔCt值來比較對照組和實驗組的目的基因相對表達量的差異。實驗所用引物見表1。

表1 MMP11 和GAPDH 的引物序列Tab.1 The primer sequences of MMP11 and GAPDH

1.3.6 蛋白質免疫印跡（western blot）收集各處理組細胞用預冷的全蛋白裂解液冰上裂解10 min后，將等量蛋白于100 V 進行SDS-PAGE。電泳結束后，以60 V、120 min 將蛋白遷移至NC 膜，一抗4 ℃過夜孵育，加辣根過氧化酶標記的二抗山羊抗兔IgG，室溫下孵育120 min，之后用ECL 試劑盒（Solarbio，Beijing，China）進行發光反應，拍照觀察蛋白印記。抗體：有關使用抗體的詳細信息見表2。實驗重復3 次。

表2 實驗中所有抗體的相關信息Tab.2 Information about all the antibodies in the experiment

1.3.7 Transwell實驗分離HCT15細胞，在PBS中洗滌兩次，然后再懸浮在無血清RPMI-1640 中。將5 × 105個細胞按200 μL 置入Matrigel 基質包被的上室中，下腔內填充400 μL RPMI-1640/10%胎牛血清。孵育24 h 后，輕輕刮去上腔內未遷移的細胞，并對膜下表面的細胞用0.5% 結晶紫染色后，顯微鏡下觀察，拍照。

1.3.8 細胞劃痕實驗將HCT15 細胞（5 × 105）接種在6 孔板上，當細胞長到80%的時候。用移液槍槍頭在孔平面輕輕劃過，PBS 洗滌細胞3 次，去除游離細胞。加入無血清培養基，培養24 h 后，顯微鏡下觀察和拍照0 h 和24 h 的細胞遷移情況。

1.4 統計學方法所有實驗均進行3 次平行實驗，并用GraphPad Prism8.0 進行統計學分析，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MMP11 在結直腸癌患者和組織中高表達UALCAN 數據庫獲得結直腸癌患者中TOP25 高表達基因（P＜0.05，圖1A），發現MMP11 在結腸腺癌患者中顯著高表達（P＜0.05，圖1B）。此外，分別在GEPIA2 和ENCORI 數據庫中證實MMP11 在結直腸癌中高表達（P＜0.05，圖1C-D）。從成都醫學院第二附屬醫院核工業四一六醫院獲得20 例結直腸癌患者癌及癌旁組織，qRT-PCR 實驗發現MMP11 在癌組織中高表達（P＜0.001，圖1E），這與數據庫結果相一致。qRT-PCR 和western blot 分析正常人結腸上皮細胞及結直腸癌細胞，結果顯示相較于正常人結腸上皮細胞MMP11 在結直腸癌細胞中mRNA 和蛋白表達水平均顯著提高（P＜0.001，圖1F-G）。因為HCT15 細胞中MMP11 表達水平最高，因此采用HCT15 細胞進行下一步研究。

圖1 MMP11 在結直腸癌患者和組織中高表達Fig.1 MMP11 is highly expressed in COAD patients and tissues

2.2 EIF4A3結合并穩定MMP11 mRNAENCORI數據庫分析發現MMP11 mRNA 能和EIF4A3 蛋白結合（圖2A），并且RIP 實驗發現EIF4A3 蛋白能夠與MMP11 mRNA 共沉淀（圖2B），證實EIF4A3 蛋白和MMP11 mRNA 之間的相互作用。RBP 能延長mRNA 的半衰期，增強其穩定性。因此在HCT15和DLD1 細胞中通過添加放線菌素D 檢測MMP11 mRNA 的半衰期，結果顯示降低EIF4A3 表達后MMP11 mRNA的半衰期縮短（P＜0.05，圖2C），這表明EIF4A3能結合MMP11 mRNA，并增強其穩定性。

圖2 EIF4A3 結合增強MMP11 mRNA 穩定性Fig.2 EIF4A3 combined to enhance the stability of MMP11 mRNA

2.3 EIF4A3 調節MMP11 蛋白表達上述研究證實EIF4A3 能增強MMP11 mRNA 的穩定性，因此在HCT15 細胞中通過western blot 檢測分別干擾EIF4A3 表達和過表達EIF4A3 后對MMP11 蛋白表達的影響。與陰性對照組相比，抑制EIF4A3表達能在一定程度上降低MMP11蛋白表達水平（P＜0.05）；而過表達EIF4A3則能在一定程度上增加MMP11的蛋白表達水平（P＜0.05，圖3）。表明EIF4A3 能在一定程度上增加MMP11蛋白的表達水平。

圖3 EIF4A3 調節MMP11 蛋白表達Fig.3 EIF4A3 regulates MMP11 protein expression

2.4 過表達MMP11 反轉了EIF4A3 敲低對侵襲遷移的抑制與陰性對照相比，轉染si-EIF4A3 后，MMP11蛋白表達水平降低，而同時轉染si-EIF4A3+pEGFP1-MMP1 則在一定程度上回復MMP11 蛋白表達（P＜0.05，圖4A）。Transwell 實驗發現干擾EIF4A3 后，侵襲細胞數明顯減少，而同時轉染si-EIF4A3 + pEGFP1-MMP1 使HCT15 細胞的侵襲能力得到一定程度的回復（P＜0.05，圖4B）；劃痕實驗發現干擾EIF4A3 后，細胞遷移能力減弱，而同時轉染si-EIF4A3+pEGFP1-MMP1 則逆轉上述作用（P＜0.05，圖4C）。表明過表達MMP11 能在一定程度上逆轉EIF4A3 敲低對HCT15 細胞的抑制作用。

圖4 過表達MMP11 逆轉EIF4A3 敲低對侵襲遷移的抑制作用Fig.4 Overexpression of MMP11 reverses the inhibitory effect of EIF4A3 knockdown on invasion and migration

2.5 MMP11過表達反轉了EIF4A3敲低對EMT相關蛋白的影響western blot 分別檢測抑制EIF4A3表達和共轉染si-EIF4A3+ pEGFP1-MMP11 后對HCT15 細胞中EMT 相關蛋白的影響，結果顯示和陰性對照組相比，EIF4A3 抑制組E-cadherin 蛋白表達增加（P＜0.001），Vimentin、N-cadherin 蛋白表達降低（P＜0.001）；而共轉染si-EIF4A3+pEGFP1-MMP11 后發現與EIF4A3 抑制+MMP11 過表達對照組相比，Vimentin、N-cadherin 蛋白表達略有升高，E-cadherin 蛋白表達降低（P＜0.05，圖5）。表明抑制EIF4A3 表達抑制EMT 進程，而MMP11 過表達反轉了EIF4A3 敲低對EMT 的抑制作用。

圖5 過表達MMP11 逆轉EIF4A3 敲低對EMT 相關蛋白的影響Fig.5 Overexpression of MMP11 reverses the effect of EIF4A3 knockdown on EMT-related proteins

3 討論

目前結直腸癌的治療形勢依舊十分嚴峻，大多患者確診時發現癌細胞已經發生轉移，導致結直腸癌患者的療效不佳、預后不良［11］。EMT 是許多惡性腫瘤（包括結直腸癌）發生局部和遠處轉移所必須的轉化過程［12］，MMP 則在這一過程中發揮重要作用。有研究指出MMP2、MMP9、MMP3、MMP8、MMP11 等一系列MMP 家族蛋白酶廣泛參與各種癌癥的侵襲和轉移當中［13-14］。MMP11 在多種癌癥中高表達，并且和乳腺癌［15］、透明細胞腎癌［16］、胰腺癌［17］等癌癥的臨床特性相關，可以作為腫瘤診斷和預后標志物。敲除MMP11 能夠抑制胃癌細胞的增殖和侵襲［10］，并且miRNA 能夠通過靶向吸附MMP11 發揮腫瘤抑制作用［18］。但是MMP11 在結直腸癌中的研究寥寥無幾，大多局限在其作為生物標志物的研究上，本文中通過UALCAN、GEPIA2 和starbase 數據庫查詢發現MMP11在結直腸癌中高表達，在我院獲得的20 例CRC 組織樣本中同樣發現MMP11 高表達，同時RT-PCR和western blot 實驗結果顯示MMP11 在SW480、HCT15、DLD1、SW620 等CRC 細胞系中高表達，并且在HCT15 細胞系中表達程度最高。為了進一步挖掘MMP11 在結直腸癌中發揮的作用，筆者通過ENCORI 數據庫發現MMP11 能和EIF4A3 相互作用，但是其具體調控機制還尚未有研究報道。

RNA 結合蛋白（RNA-binding proteins，RBP）是細胞中一類能和RNA 特異性結合的蛋白質，進而參與RNA 的剪切、轉運、翻譯、定位等一系列轉錄后調控作用［19］。RBP 廣泛參與多種癌癥的發生發展及炎癥反應，并有研究指出RBP可以作為癌癥新的治療位點［20-21］。EIF4A3 在腫瘤的發生、發展、癌基因表達、腫瘤細胞侵襲和轉移中發揮重要作用［22］。研究報道EIF4A3 在多種癌癥中高表達，并且能夠促進三陰乳腺癌［22］、膠質母細胞瘤［23-24］、非小細胞肺癌［25］、上皮性卵巢癌等癌癥的惡性進展，這表明EIF4A3 在癌癥中作為致癌因子發揮作用。本研究通過RIP 實驗發現EIF4A3 能夠和MMP11 mRNA 相互作用，增強MMP11 mRNA 的穩定性，并通過western blot實驗證實抑制EIF4A3表達能夠降低MMP11 蛋白表達水平，而過表達EIF4A3能夠增加MMP11 蛋白表達水平。此外，在HCT15細胞中抑制EIF4A3 表達，transwell 和劃痕實驗檢測HCT15 細胞侵襲和遷移能力的變化，結果顯示抑制EIF4A3 表達能抑制HCT15 細胞的侵襲和遷移能力，而抑制EIF4A3 表達的同時過表達MMP11能夠逆轉上述現象。western blot 實驗結果顯示抑制EIF4A3 表達抑制EMT 過程，而抑制EIF4A3 表達的同時過表達MMP11 Vimentin、N-cadherin 蛋白表達增加，E-cadherin 蛋白表達降低，逆轉了抑制EIF4A3 對EMT 的抑制作用。

綜上所述，MMP11 在結直腸癌組織和HCT15細胞中高表達，EIF4A3能夠和MMP11相互作用，并增加MMP11 mRNA的穩定性。干擾EIF4A3表達能抑制結直腸癌細胞的侵襲、轉移和EMT，而同時過表達MMP11 則能逆轉上述作用，說明EIF4A3 通過結合MMP11 增加MMP11 mRNA 的穩定性，促進了結直腸癌細胞的增殖、遷移和EMT。