食品(飲料)加工車間機載微流控霉菌檢測裝置

趙中營 徐佩鋒 嚴 方

(江蘇農林職業技術學院，江蘇 鎮江 212400)

霉菌是自然界分布極其廣泛的真菌，其孢子直徑一般為2～10 μm，可借助于空氣流動散播到較遠的地方。霉菌孢子的繁殖能力極強，在適宜的環境條件下可大量生長繁殖，污染環境，引起傳染。食品(飲料)加工車間一旦污染霉菌，在水分活性、溫度、濕度等適宜條件下，會快速生長繁殖導致食物變質，甚至產生毒性。食品生產企業由于空氣污染到食品出現菌落總數超標等問題不是個別現象，面對越來越嚴格的國標，越來越多的食品企業開始注重車間內空氣中霉菌孢子數的控制。在食品(飲料)加工車間空氣中快速檢測霉菌，有助于快速切斷霉菌的源頭以及傳播途徑，并且針對性地進行霉菌防范處置。

單一的微生物檢測技術采用的是菌落直接沉降法[1]，在車間選擇取樣點通過采集沉降菌進行培養計數的方式測定生產環境中的污染程度，該方法需要專業的技術人員及相應的培養條件。隨著光學傳感技術的發展，可以利用粒子在光照下成像的原理實現對空氣中霉菌孢子的采集，從而判斷環境污染程度，但光學成像后專業圖像辨識技術對空氣中微顆粒的有效分類比較復雜，受到顆粒疊加、光學陰影等因素干擾，影響了霉菌孢子污染數據的準確性[2-3]。在倉儲等領域一定濃度的霉菌孢子的檢測，可以通過CO2濃度等關聯性參數測量獲取[4]，但此類檢測方法需要霉菌達到足夠的濃度。采用分子生物學快速檢測技術可以檢測到非常微量真菌數量，可達10 個/mL[5]，但需要對特定基因以及特異性引物進行針對性選擇與設計。

微流控是一種廣泛應用于微量微顆粒檢測的技術[6-8]，可以在空氣中捕獲微量的霉菌孢子，微流控芯片通過專業的動力學設計，可以將空氣中的微顆粒進行分離，從而針對粒徑為2～10 μm的霉菌進行富集；室內無人機因為其靈活機動性能，在室內巡邏、倉儲盤點等方面有著廣泛應用。研究擬采用室內無人機加載微流控芯片檢測食品(飲料)加工車間空氣中的霉菌孢子，以期為食品(飲料)加工車間有效監測并防控霉菌孢子污染提供一個新的途徑。

1 霉菌孢子捕捉裝置

傳統的孢子捕捉裝置直接將霉菌孢子富集在載玻片上，再通過顯微鏡對富集后的微顆粒進行辨識。這種辨識一方面需要非常專業的知識，另一方面載玻片上各種微顆粒的疊加情況較為嚴重，即便是顯微鏡下也難以分辨。食品(飲料)加工車間的空氣中霉菌孢子數量較少，而微流控的孔徑也是非常小，因此直接用微通道采集空氣中的孢子非常困難，要想快速捕捉到霉菌孢子，就需要在微流控芯片入口處設計一個霉菌孢子捕捉裝置，其基本原理是通過微正壓形成孢子捕捉區域的空氣微循環，再利用微流控芯片的負壓風機提高捕捉空氣中霉菌孢子的概率。通過負壓風機強制監視空間的空氣流動，可以增加孢子在捕捉口出現的概率，而且根據空氣動力學原理，強制流動可以引起循環空氣氣流多次縮放，使得捕捉室內循環空氣中的水汽凝結與汽化現象比不流通空氣更為顯著，從而增強水汽凝結后的微顆粒聚集作用，增加空氣中微顆粒在空氣中的駐留時間，提高捕捉室內的微顆粒密度。

圖1為機載霉菌孢子捕捉裝置，通過通流負壓風機形成監測區域空氣循環。空氣的循環為空氣中的孢子以及其他微顆粒帶來摩擦力，從而形成對孢子與其他微顆粒的牽引力，使空氣中的孢子隨著空氣在捕捉通道內循環流動。空氣在捕捉窗、捕捉孔、縮放孔、通流孔等區域縮放，會增加空氣中的水汽凝結與汽化現象發生概率，從而增加微顆粒在空氣中隨空氣流動的阻尼，當阻尼大于孢子和其他微顆粒的牽引力，會使孢子或其他微顆粒減速，增加孢子在采集裝置中的停留時間。采集裝置從前后左右下側收集周邊空氣，從上側排出空氣，無人機機翼又使排出空氣向下流動，這樣可以形成采集區域的空氣循環。

1. 通流負壓風機 2. 微流負壓風機 3. 富集窗 4. 微流控芯片 5. 鞘流壓縮空氣泵 6. 富集孔 7. 縮放孔 8. 通流孔 9. 殼體

微流控芯片的微通道為100 μm(高)×500 μm(寬)，微顆粒通過微流負壓風機進入通道形成霉菌孢子的空氣流，在分離區通過鞘流壓縮空氣泵進行微顆粒分離。微流負壓風機與鞘流壓縮空氣泵轉速對于霉菌孢子的富集與分離具有一定影響，需要結合通道長度、微顆粒種類等進行設置。

2 微流控芯片

參照Xu等[9]設計的一種針對2～10 μm的霉菌進行富集的微流控芯片(如圖2所示)設計富集微流控芯片。其前端為采集管，通過微流負壓風機使霉菌孢子在微管道以V0的流速移動。在微流控芯片中部設計有一個鞘流壓縮空氣泵，形成鞘流，用于偏轉微顆粒，分離出霉菌孢子。分離富集邊緣采用流型設計，微粒子在鞘流作用下發生不同的偏轉，如圖4所示富集在不同的區域。

1. 采集口 2. 加速通道 3. 本體 4. 富集與分類區 5. 微流負壓風機口 6. 鞘流通道 7. 鞘流壓縮空氣泵入口

有研究[10]表明，室內氣溶膠在2.79～10.00 μm的微顆粒數量較少，在2 μm以下的微顆粒數量較多。在嚴格控制氣溶膠的食品(飲料)加工車間，2.79～10.00 μm的微顆粒數量更少。空氣中的微顆粒大致分為兩類：密度較大的灰塵顆粒和相對密度較小的孢子顆粒。而微流控芯片可分離出2.79～10.00 μm的灰塵顆粒(Ⅰ類顆粒)，2.79～10.00 μm的霉菌孢子顆粒(Ⅱ類顆粒)，2.79 μm以下的灰塵顆粒和霉菌孢子顆粒(Ⅲ類顆粒)，10.00 μm以上的灰塵顆粒(Ⅳ類顆粒)，以及10 μm以上的孢子顆粒(Ⅴ類顆粒)。

微流控芯片加速通道的靜摩擦系數較小，氣流對微顆粒的牽引力足以克服其摩擦力，當加速通道足夠長時，在微流負壓風機作用下氣溶膠各微顆粒在加速通道出口的初速度(V0)與氣流速度一致。富集區域靜摩擦系數較大，當顆粒進入富集區域后其所承受的摩擦力大于氣流的索引力時，便沉降富集在富集區域。

微流控芯片對微顆粒進行篩選的基本原理見圖3(a)和圖3(b)，微顆粒在通道中的受力見圖3(c)。在鞘流的作用下，微顆粒體積越大所獲得的縱向速度Vy越大，質量越大摩擦力越大，而微流負壓風機作用下的氣溶膠各微顆粒初速度V0是一致的。根據式(1)在富集區不同粒徑微顆粒的垂直位移Sy有差異。直徑大的微顆粒在FD的作用下，垂直位移Sy較大，直徑小的Sy較小。質量大的微顆粒承受的阻力大，橫向速度下降快，其富集區域離出口近，質量小的離富集區域出口遠。根據受力分析5類氣溶膠顆粒出現較大概率的富集區域如圖4所示。

圖3 微顆粒在微流控芯片中受力分析

圖4 不同顆粒的大概率富集區域示意圖

Sy=LJGVy/V0，

(1)

式中：

Sy——微顆粒的垂直位移，μm；

LJG——通道x軸行程，μm；

V0——氣溶膠各微顆粒初速度，μm/s；

Vy——鞘流作用下微顆粒y軸速度分量，μm/s。

3 機載微流控霉菌檢測裝置在食品(飲料)加工車間檢測效果

3.1 檢測方案設計

試驗采用微型無人機作為霉菌孢子捕捉裝置的載體，微型無人機對采集區域的氣流擾動較小，同時圖1所設計的負壓捕捉裝置在一定程度上減弱了微型無人機的氣流擾動影響。試驗樣本霉菌孢子是2020年4月由江蘇農林職業技術學院于人工氣候室內培養獲得，試驗利用氣溶膠發生器可將孢子樣本制作成氣溶膠粒子，均勻釋放在單位體積為1，10，100 L的容器中，獲不同濃度的樣本。分別取105，104，103個/mL的樣本，在無人機檢測過程中噴制時間為10 s，允許自然沉降，噴制在無人機采集點的上方，分別采用傳統的落板法和微流控采集法進行霉菌氣溶膠采集，富集時間均設定為20 min，富集后的載玻片和微流芯片均采用光學顯微鏡觀察成像，采用顯微圖像法計算獲得平均孢子濃度。

3.2 結果與分析

不同濃度下微流控法的霉菌孢子富集圖片在光學顯微鏡下的成像如圖5所示。105，104，103個/mL試驗環境下微流控法收集的霉菌孢子分別為367，73，19個，而采用傳統落板法的分別為63，22，0個。從試驗結果來看，采用無人機機載微流控芯片可以快速收集到空氣中游離的霉菌孢子，在光學顯微鏡下收集到的孢子數量隨著濃度的增加而增加，但試驗結果雖然反映出孢子濃度的大小趨勢，但并未建立嚴格的線性關系(見圖6)。這種非線性關系現象一方面與微流控芯片微通道自身的采集概率相關[8]，同時在一定程度上受到無人機對采集區域氣流的擾動影響。

圖5 霉菌孢子富集后光學顯微成像

4 霉菌孢子的圖像分析與數量統計算法

4.1 圖像灰度計算

Canny邊緣檢測算子是John F. Canny于1986年提出的。經典Canny算法用了4個梯度算子來分別計算水平，常用的邊緣差分算子有Rober、Prewitt、Sobel。使用Canny算法前先要將圖6按式(2)進行灰度化。

圖6 霉菌孢子噴灑濃度與檢測數非線性關系

Gr(x,y)=0.229R(x,y)+0.587G(x,y)+0.114B(x,y)，

(2)

式中：

Gr(x,y)——待求像素點(x,y)的灰度值；

R(x,y)——待求像素點(x,y)的顏色值R分量；

G(x,y)——待求像素點(x,y)的顏色值G分量；

B(x,y)——待求像素點(x,y)的顏色值B分量。

4.2 Canny算子低通濾波與邊緣特征計算

對灰度圖像Gr(x,y)進行卷積低通濾波，濾波函數選取Gs(x,y):

(3)

Canny算子通過應用高斯函數Gs(x,y)對灰度圖像進行卷積低通濾波，形成式(4)。

f(x,y)=Gs(x,y)*Gr(x,y)，

(4)

式中：

*——卷積。

使用一階有限差分[式(5)、式(6)]近似計算x與y偏導數的兩個陣列。

(5)

(6)

再通過x與y偏導數的兩個陣列計算圖像的邊緣梯度幅值和邊緣的發展方向值，用于圖像邊緣提取的特征判據，分別用M(x,y)、θ(x,y)表達。

(7)

(8)

4.3 Canny算子的簡化計算與邊緣特征提取

為了進一步簡化計算，也可以根據式(9)、式(10)近似計算圖像的邊緣梯度幅值和邊緣的發展方向值M(x,y)、θ(x,y)。

(9)

(10)

進一步對M(x,y)進行非極大值抑制，用雙閾值算法檢測和連接邊緣。檢測效果如圖7所示，對照圖5可以發現所提取的霉菌孢子數量要與實際的霉菌孢子數量基本接近，尤其是圖7(b)、圖7(c)十分顯著，但個別孢子形狀也變小了。從圖7的實際處理效果來看，孢子在疊加的情形下，如圖7(b)、圖5(b)所示，難以通過圖像邊緣分割后獲得準確的孢子數量。通過圖7與圖5的對比，在Canny算子邊緣檢測過程中，孢子辨識的直徑總體趨于直徑變小，變小的比例與孢子成像的邊緣特征相關，因此需要對Canny算子進行進一步優化，以確保圖像辨識的保真度。

圖7 Canny算法檢測效果

5 結論

采用霉菌孢子前端采集裝置和微流控富集裝置，可以快速采集到食品(飲料)加工車間噴灑的霉菌孢子，試驗最小的測試濃度為103個/mL，所收集到的孢子數量為19個，而傳統的落板法測量不到。在試驗過程中，機載微流控霉菌孢子檢測裝置所采檢測到的孢子數量可以反映噴灑在空氣中的霉菌孢子濃度增長趨勢，但并未建立線性關系，其測量的非線性一方面受到霉菌孢子在空氣中的擴散速度和噴灑方式影響，另一方面也與無人機機翼氣流的擾動有一定關系。同樣傳統的落板法所采檢測到的孢子數量與噴灑在空氣中的霉菌孢子濃度也不存在很顯著的線性關系。采用機載無人機在空氣中檢測食品(飲料)生產車間霉菌污染，不僅可行，并且操作非常簡單，實施成本也非常低，是一種值得進一步研究的檢測方式。后續將進一步研究無人機的飛行路徑對孢子濃度檢測的影響、霉菌孢子的圖像辨識計數等。