不同培養基對水稻花藥培養力的影響

查中萍，郭 英，殷得所，胡建林，鄭興飛，董華林，劉艷芳，王紅波，薛 蓮，徐得澤

（1.湖北省農業科學院糧食作物研究所/農業農村部作物分子育種重點實驗室/糧食作物種質創新與遺傳改良湖北省重點實驗室，武漢 430064；2.湖北洪山實驗室，武漢 430070；3.湖北省科技信息研究院，武漢 430064）

水稻（Oryza sativaL.）是中國重要的糧食作物之一［1］，肩負著國家糧食安全、滿足人們不斷提高的消費需求以及農民增收、農業環境可持續發展的第一重任，一直被視為重要的戰略物資［2］。水稻花藥培養可以快速獲得水稻純系、提高選擇效率、縮短育種周期［3］，再生植株雙單倍體（DH）系也是分子標記和基因圖譜的理想材料。水稻花藥培養始于1968 年，日本學者新關（Niizeki）和大野（Oono）利用花藥培養技術首次獲得水稻單倍體植株［4］，開啟了水稻花藥培養的先河［5］。1970 年，中國開始研究水稻花藥培養，并于1975 年第1 次利用花藥培養技術育成粳稻新品種單豐1 號［6］。近年來，隨著研究的不斷深入，水稻花藥培養技術也在逐步完善，并與其他技術相結合應用在遺傳育種上，已經成為生物育種技術中相對成熟、實用而且有效的技術［4］。水稻花藥培養及單倍體育種，是生物技術在農作物育種中應用最廣泛、最有成效的領域［7］。中國開展水稻花藥培養及育種應用研究取得了許多成就，花藥培養技術不斷改進、完善，研究出用于水稻花藥培養的培養基有N6［8］、合5、通用、L8、SK3 等［9］；通過花藥培養育出中花8 號、中花9 號、花寒早、新秀、朝花矮等優良水稻新品種，已成功在生產上推廣應用［10，11］。隨著花粉植株性狀表現及遺傳機理、生理生化研究的深入，花藥培養育種相關理論得以不斷形成和充實。

本研究以N6、合5、SK3、M8 及改良的M8（簡稱GM8）培養基為基礎培養基，篩選愈傷組織誘導效率高的誘導培養基，設置單一生長調節劑與復合生長調節劑對比試驗，以秈稻、粳稻、野生稻為試驗材料，廣泛而又有重點地選配水稻材料進行花藥培養試驗，為探索不同培養基的花藥培養效果，獲得遺傳基因型豐富的花藥培養后代提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試水稻品種（組合）：X1、HB568（粳稻），JL117、HB613（秈稻），HB570（糯稻）及21ah36（野生稻）。試驗于湖北省農業科學院糧食作物研究所南湖試驗基地開展，秧齡25～30 d 移栽，水稻的播種、移栽及接種時間詳見表1。

表1 水稻播種、移栽及接種時間

1.2 培養基

水稻花藥培養基本培養基配方見表2。誘導培養基采用N6［8］、M8［12］、合5［13］、SK3［14］以及GM8 為基本培養基，以MS+2.0 mg/L KT+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA 為分化培養基［3］，誘導培養基配方見表3。

表2 水稻花藥培養基本培養基 （單位：mg/L）

表3 水稻花藥培養誘導培養基配方 （單位：mg/L）

1.3 水稻花藥培養取材及預處理

水稻花藥培養取材及預處理參照文獻［3］。

1.4 培養條件

將接種花藥后的三角瓶放入培養室中進行暗培養，培養溫度為26 ℃。待愈傷組織長到直徑2 mm左右時轉移到分化培養基上，光照誘導器官分化，每天用日光燈補充光照10 h，培養溫度為26～28 ℃。

1.5 試驗設計

以生育期比較早的X1（粳稻）及JL117（秈稻）為試驗材料，利用5 種誘導培養基I1、I2、I2、I4、I5 進行愈傷組織誘導，每種培養基接種40 瓶，每瓶100 枚，即每種培養基接種4 000 枚花藥，50 d 后統計愈傷組織誘導情況，統計愈傷組織誘導率。篩選出最佳誘導基本培養基后，對HB613、HB568、HB570、21ah36 4 個品種（組合）進行單一/復合生長調節劑試驗。試驗設計方案參照文獻［3］花藥培養方法和文獻［15］成熟胚培養誘導愈傷組織配方。

1.6 計算參數及方法

愈傷組織誘導率=愈傷組織數/接種花藥數×100%，綠苗分化率=綠苗分化數/愈傷組織數×100%，花藥培養力=愈傷組織誘導率×綠苗分化率×100%。

2 結果與分析

2.1 不同基本培養基對愈傷組織誘導率的影響

以X1（粳稻）及JL117（秈稻）為試驗材料，X1 誘導20 d 后各培養基陸續有愈傷組織出現，JL117 接種15 d 開始有愈傷組織出現。各基本培養基誘導出愈傷組織的初始時間沒有明顯差異，但是各基本培養基誘導的愈傷組織的數量有明顯不同，接種30 d后，X1 及JL117 在I5 誘導培養基上誘導的愈傷組織數量明顯高于其他培養基，且I5 培養基上的愈傷組織大而質地緊密、顏色鮮黃，達到愈傷組織分化培養的條件。接種50 d 后統計愈傷組織誘導率（表4），從表4 可以看出，不同的基本培養基對水稻花藥培養效果不同，I5 誘導培養基對秈稻、粳稻的效果都較好，誘導率較高，因此最佳誘導培養基為GM8+1.0 mg/L KT+2.0 mg/L 2，4-D+3.0 mg/L NAA。

表4 各種誘導培養基對花藥培養力的影響

2.2 單一/復合生長調節劑對花藥培養力的影響

以GM8 培養基為基本培養基，設置僅添加2，4-D 單一生長調節劑的I6 培養基與復合培養基I5（CK）比較，探討單一生長調節劑與復合生長調節劑對水稻花藥培養誘導力的影響（表5）。從表5 可以看出，無論是粳稻、秈稻、糯稻或野生稻，4 種材料在復合生長調節劑I5 培養基及單一生長調節劑I6 培養基上，都能誘導愈傷組織產生。其中，除HB613在復合生長調節劑培養基上的誘導率高于單一生長調節劑培養基外，其他品種在復合生長調節劑或單一生長調節劑培養基上的誘導率并沒有明顯差異，甚至單一生長調節劑的誘導率還略高于復合生長調節劑培養基，說明以GM8 為基本培養基，僅添加2，4-D 單一生長調節劑也能夠很好地誘導愈傷組織產生。進一步分化試驗發現，4 種材料在復合生長調節劑的誘導培養基上，愈傷組織上的綠苗率均高于單一生長調節劑，說明復合生長調節劑能提高花藥培養力。

表5 單一/復合生長調節劑對花藥培養力的影響

3 小結與討論

成功的花藥培養在一定程度上依賴于培養基的選擇，不同的培養基對不同基因型的水稻材料有不同的培養效果，目前研究主要集中在M8、合5 和N6等幾種培養基上［16］。本研究采用N6、合5、SK3、M8以及改良的M8 培養基（GM8）為基本培養基對粳稻X1 及秈稻JL117 進行花藥培養力研究，結果表明在1.0 mg/L KT+2.0 mg/L 2，4-D+3.0 mg/L NAA 的GM8培養基上獲得了較高的愈傷組織誘導率，因此GM8培養基是水稻花藥培養的最佳基本培養基。

在植物離體培養過程中，外源生長調節劑被認為是植物胚胎發育所必需的［17］。外源生長調節劑可以促進愈傷組織的發生和分化，在水稻花藥培養中扮演著重要角色，但研究發現單一成分的生長調節劑培養效果并不理想，而幾種生長調節劑的搭配使用卻可以在花粉脫分化階段為組織的分化和成苗提供便利，由此可見水稻花藥培養是一個復雜的生理生化過程，使用合理的生長調節劑組分及不同的生長調節劑配比是影響花培效率的重要因素［18，19］。本研究以GM8 為基本誘導培養基，設計了單一和復合生長調節劑配比后，發現單一生長調節劑2，4-D在GM8 基本培養基上對秈稻、粳稻、糯稻及野生稻都有較好的愈傷組織誘導效果。

有研究表明［20-22］，單一生長調節劑培養花藥培養力效果較差，復合生長調節劑能明顯提高花藥培養力。施利利等［23］進行不同生長調節劑的配比組合試驗，得出合理添加2，4-D、NAA 和KT 相對于只添加2，4-D 的培養基，不僅出愈率高，而且愈傷質量好。王伍梅等［24］認為，對于粳稻或秈粳交后代誘導生長調節劑僅用2，4-D 是可行的。本研究結果表明，添加復合生長調節劑的培養基雖然沒有明顯地提高愈傷組織誘導率但綠苗分化率高，即復合生長調節劑配比的培養基對水稻花藥培養力較高。