地黃炮制過程中HPLC-RID 指紋圖譜及模式識別研究

張麗先，寧二娟，李智寧，魏 悅，李飛飛，張?zhí)姨?/p>

（河南省科學院，a.河南省納普生物技術(shù)有限公司；b.天然產(chǎn)物重點實驗室，鄭州 450002）

地黃為玄參科植物地黃（Rehmanniae radix）的新鮮或干燥塊根，秋季釆挖，除去蘆頭、須根及泥沙，鮮用，習稱“鮮地黃”；除鮮用外，進行初步處理和干燥，得另一種鮮地黃形式地黃片，便于儲存，以保證中藥材質(zhì)量；將地黃緩緩烘焙至約八成干，習稱“生地黃”；生地黃酒燉至酒吸盡，取出，晾曬至外皮黏液稍干時，切厚片或塊，干燥，即得熟地黃。鮮地黃清熱生津、涼血止血，用于熱病傷陰、舌絳煩渴；生地黃清熱涼血、養(yǎng)陰生津，用于舌絳煩渴、陰虛內(nèi)熱；熟地黃滋陰補血、益精填髓，用于肝腎陰虛、血虛萎黃［1-5］。

鮮地黃、生地黃、熟地黃藥性迥異，主要歸因于加工炮制過程中化學成分的變化。糖類成分在地黃中含量很高，其中鮮地黃中水蘇糖含量高達60%。研究表明低聚糖類成分有調(diào)節(jié)腸道菌群、調(diào)節(jié)血糖和血脂、保肝、抗腫瘤的功效，是一種極佳的功能性食品原料［6］。開展炮制前后地黃中糖類成分變化的研究對于低聚糖產(chǎn)品開發(fā)意義重大，為此，本試驗建立地黃炮制過程中不同炮制品HPLC-RID 特征圖譜分析方法，同時測定地黃中果糖、葡萄糖、蔗糖、棉子糖、水蘇糖5 種糖類成分含量，以期借助模式識別評估鮮地黃（包括地黃片）-生地黃-熟地黃不同炮制品中糖類成分差異。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 Agilent 1260 高效液相色譜儀，ME204萬分之一電子天平（梅特勒托利多儀器上海有限公司）；AUW 220D 十萬分之一天平（日本島津公司）；KQ-500E 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.1.2 藥品與試劑 葡萄糖（批號110833-201506，純度99.9%）、水蘇糖（批號112031-201701，純度90.5%）購自中國食品藥品檢定研究院；果糖（批號171202）、蔗糖（批號17042602）、棉子糖（批號1704705），純度≥98%，購自成都普菲德生物技術(shù)有限公司，乙腈為色譜純（天津四友精細化學品有限公司），水為娃哈哈純凈水。

1.1.3 地黃來源 鮮地黃、生地黃購自河南省各地，熟地黃由實驗室依據(jù)酒燉法自行炮制。地黃來源見表1。

表1 12 批地黃來源

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 Agilent ZORBAX NH2色譜柱（250.0 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈-純水（70∶30，體積比）混合溶液為流動相，流量1.0 mL/min，柱溫40 ℃，RID 溫度50 ℃。

1.2.2 供試品溶液配制 鮮地黃切成小塊，研碎；生地黃、熟地黃切成約5 mm 的小塊，經(jīng)80 ℃減壓干燥24 h 后，磨成粗粉。鮮地黃取約2.0 g（地黃片、生地黃、熟地黃取約0.5 g），精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入50%乙腈25 mL，稱定重量，超聲（500 W，40 kHz）30 min，放冷，再稱定重量，用50%乙腈補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

1.2.3 對照品溶液配制 取適量果糖、葡萄糖、蔗糖、棉子糖及水蘇糖對照品，用50%乙腈溶解于5 mL容量瓶中，得1 mg/mL 的混合對照品溶液，混合對照品及單一對照品色譜見圖1。

圖1 混合對照品及單一對照品HPLC-RID 色譜圖

1.2.4 HPLC-RID 特征圖譜建立 按照“1.2.2”制備1～12 號供試品溶液，在“1.2.1”色譜條件下進樣分析，采集1～12 號樣品色譜圖作為HPLC-RID 特征圖譜，見圖2。

圖2 12 批樣品HPLC-RID 特征圖譜

2 結(jié)果與分析

2.1 相似度評價結(jié)果

在Open Lab 工作站中導出1～12 號樣品AIA 格式的數(shù)據(jù)文件，在中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012.130723 版本）中依次打開，設(shè)置1 號樣品色譜圖為參照圖譜，經(jīng)過多點校正、峰匹配后，計算相似度，相似度結(jié)果見表2。12 批地黃不同炮制品指紋圖譜相似度大于0.900，說明地黃炮制前后寡糖類成分種類未見顯著差異，單獨基于相似度分析不能很好地區(qū)分地黃不同炮制品。

表2 12 批樣品相似度計算結(jié)果

2.2 主成分分析

PCA 是一種使用最廣泛的數(shù)據(jù)降維算法，基本思想就是在保留原始變量盡可能多的信息的前提下達到降維的目的，從而簡化問題的復雜性并抓住問題的主要矛盾，揭示事物內(nèi)部變量之間的規(guī)律性，簡化問題，提高分析效率，得到對事物特征及其發(fā)展規(guī)律的一些深層次的啟發(fā)［7］。借助SPSS 16.0 數(shù)據(jù)分析軟件對12 批樣品5 個指標性糖類成分峰面積進行主成分分析，PC1 和PC2 兩個主成分的累積貢獻率分別為59.04%、24.05%，合計為83.09%，能夠概括地黃樣品的絕大部分信息，分類結(jié)果見圖3。

圖3 12 批地黃不同炮制品PCA（○：生地黃，◇：熟地黃，+：鮮地黃）

2.3 聚類分析

HCA 是一個把數(shù)據(jù)對象劃分成子集的過程，每個子集是一個簇，使得簇中的對象彼此相似，但與其他簇中的對象不相似。聚類的輸入是一組未被標記的樣本，聚類根據(jù)數(shù)據(jù)自身的距離或相似度劃分為若干組，劃分的原則是組內(nèi)距離最小化而組間距離最大化，是一種非監(jiān)督的算法［8］。運用SPSS 16.0 統(tǒng)計分析軟件對12 批樣品進行聚類分析，以組間聯(lián)接法聚類，平方Euclidean 距離為指標，結(jié)果見圖4。12批地黃炮制品分為3 類，其中生地黃1～4 號聚為一類，熟地黃5～7 號為一類，鮮地黃包括地黃片8～12號聚為一類，聚類結(jié)果與PCA 結(jié)果一致。表明地黃不同炮制品之間寡糖成分含量差異明顯，選定的果糖、葡萄糖、蔗糖、棉子糖、水蘇糖能較大程度上代表地黃不同炮制品之間寡糖類成分的差異。地黃片與鮮地黃中寡糖類成分無顯著差異，可作為鮮地黃難以長期儲存的解決辦法。

圖4 12 批地黃不同炮制品HCA 結(jié)果

2.4 含量測定

2.4.1 精密度試驗 取“1.2.3”混合對照品溶液，按“1.2.1”色譜條件連續(xù)進樣6 次，計算6 次測定中果糖、葡萄糖、蔗糖、棉子糖及水蘇糖峰面積的RSD，分別為1.52%、1.39%、1.25%、1.74%、0.96%、2.05%，儀器精密度良好。

2.4.2 重復性試驗 取1 號樣品，按“1.2.2”方法平行制備供試品溶液6 份，按“1.2.1”色譜條件測定，果糖、葡萄糖、蔗糖、棉子糖及水蘇糖峰百分含量的RSD依次為1.63%、2.18%、2.95%、2.68%、2.84%，該方法重復性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗 取1 號樣品，按“1.2.2”方法平行制備供試品溶液，分別于制備后0、4、8、12、24、48 h，按“1.2.1”色譜條件測定，果糖、葡萄糖、蔗糖、棉子糖及水蘇糖峰面積的RSD分別為1.75%、1.69%、2.54%、2.69%、2.87%，供試品溶液在48 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.4 加樣回收率試驗 取1 號樣品，分別精密稱取6 份0.25 g，置于25 mL 量瓶中，分別加入與已知含量等量的5 種對照品，水定容，超聲30 min，過膜，上機分析，計算各指標成分的回收率。果糖、葡萄糖、蔗糖、棉子糖及水蘇糖平均回收率分別為95.1%、98.6%、95.2%、102.7%、103.6%，RSD分別為2.15%、3.06%、3.45%、2.98%、2.66%，該方法準確可靠。

2.4.5 含量測定 將制備的1～12 號供試品溶液和混合對照品溶液按照“1.2.1”色譜條件依次進樣分析，記錄5 指標成分色譜峰峰面積，外標法依次計算果糖、葡萄糖、蔗糖、棉子糖及水蘇糖含量，具體見表3。

表3 12 批不同地黃炮制品中5 種糖的含量（單位：%，n=3）

3 小結(jié)與討論

試驗建立了HPLC-RID 法同時測定地黃不同炮制品中果糖、葡萄糖、蔗糖、棉子糖、水蘇糖5 種單糖及低聚糖含量的方法，方法可靠，便于操作。考慮到溫度、風、廢液瓶放置等環(huán)境因素對示差檢測器的穩(wěn)定及數(shù)據(jù)采集影響較大，測試開展之前需檢查儀器環(huán)境是否適宜；鑒于氨基柱反相使用耐受性差、流動相均一性對示差檢測器基線平穩(wěn)影響大，選擇單相70%乙腈為流動相；由于折光率隨溫度變化很大，溫度不恒定，噪音和靈敏度顯著受損，示差檢測器必須恒溫，綜合考慮色譜柱耐受性及出峰情況，柱溫箱、流通池溫度分別設(shè)置為40、50 ℃。

果糖、葡萄糖、蔗糖、棉子糖、水蘇糖5 種糖組分的主成分分析及聚類分析結(jié)果一致，表明5 種糖較好地表達了鮮地黃、生地黃、熟地黃之間的差異與聯(lián)系，其中切片快速冷凍干燥的地黃片與鮮地黃中5種糖類成分無明顯差異，可將地黃片作為鮮地黃的一種儲存方式，較大程度上緩解鮮地黃難以儲藏、容易腐爛變質(zhì)、發(fā)芽等問題。

地黃采摘后，在鮮地黃-生地黃-熟地黃加工炮制過程中，果糖含量逐步遞增，水蘇糖含量降低，蔗糖、棉子糖含量先升高后降低，葡萄糖含量變化不明顯。可能是炮制過程中，由于糖受熱不穩(wěn)定，水蘇糖可分解為三糖和二糖，棉子糖可分解為蔗糖、果糖等，而蔗糖又有可能分解為果糖和葡萄糖，從而使得地黃中各種糖含量處在動態(tài)變化中。