miR-367-3p調控細胞周期素D2重組蛋白表達對肺癌細胞增殖、遷移的影響

曹磊 張成立 侯穎

肺癌是起源于肺部支氣管黏膜、腺體的惡性腫瘤，具有較高的發病率及死亡率[1]。肺癌細胞的異常增殖及侵襲活動對肺癌的發展具有促進作用。微小RNA(microRNA，miR)是一類內源性非編碼RNA，其失調與肺癌細胞的增殖、侵襲活動密切相關[2]。有研究表明，miR-367-3p在非小細胞肺癌細胞中表達顯著降低，可調節癌細胞上皮間質轉化過程[3]。細胞周期素D2重組蛋白(recombinant cyclin D2 protein，CCND2)是D型細胞周期蛋白cyclin蛋白家族成員，與肺癌細胞的增殖、轉移活動聯系密切[4-5]，抑制CCND2表達可降低非小細胞肺癌細胞的增殖和轉移能力[5]。靶基因預測顯示,miR-367-3p與CCND2存在結合位點。本研究探究miR-367-3p調控CCND2表達對肺癌細胞增殖、遷移的影響。

材料與方法

一、材料

人肺癌細胞Calu、MSTO-211H、NCI-H2347、NCI-H1437、NCI-H1944、NCI-H647、人正常肺細胞HLF-a于武漢普諾賽生命科技有限公司。

二、方法

1.細胞培養：將人肺癌細胞Calu、MSTO-211H、NCI-H2347、NCI-H1437、NCI-H1944、NCI-H647、人正常肺細胞HLF-a接種到RPMI1640培養基(含10%FBS)于37 ℃、5%CO2培養箱中培養，每2天更換1次新鮮培養基。

2.肺癌細胞中miR-367-3p表達水平的測定：收集對數生長期人肺癌細胞Calu、MSTO-211H、NCI-H2347、NCI-H1437、NCI-H1944、NCI-H647、人正常肺細胞HLF-a，提取細胞總DNA，經逆轉錄合成cDNA，以U6作為內參，進行qRT-PCR擴增。miR-367-3p引物序列5'-3'：上游AGTGCAGGGTCCGAGGTATT，下游CGACGAATTGCACTTTAGC；U6引物序列5'-3'：上游CGAGCACAGAATCGCTTCA，下游CTCGCTTCGGCAGCACATAT。根據2-△△CT算法分析miR-367-3p相對表達水平，實驗重復3次。

3.細胞分組及轉染：收集人肺癌細胞Calu，分為對照組(正常培養)、miR-367-3p NC組(轉染miR-367-3p陰性對照)、miR-367-3p mimic組(轉染miR-367-3p模擬物)、miR-367-3p mimic+pc-CCND2組(共轉染miR-367-3p模擬物和pc-CCND2)。使用EntransterTM-R4000轉染試劑對各組細胞進行相應轉染。

4.肺癌細胞Calu的細胞活力測定：將Calu細胞按照1 500個/孔接種于96孔板，培養24 小時后加入CCK-8試劑，繼續培養4小時后，全自動酶標儀測定各孔吸光度值，按照公式計算各組Calu細胞活力。細胞活力(%)=(A測定-A空白)/(A對照-A空白)×100%。

5.肺癌細胞Calu凋亡情況測定：調整Calu細胞濃度為1×106個/ml，取100 μl置于流式管中，依次加入5 μl AnnexinV/Alexa Fluor、10 μl碘化丙啶(PI，20 μg/ml)溶液，混勻、避光室溫孵育15 分鐘后加入400 μl的PBS緩沖液，于流式細胞儀中檢測Calu細胞凋亡情況。

6.肺癌細胞Calu侵襲、遷移能力測定：調整Calu細胞濃度為1×105個/ml，在24孔板中放入鋪設好Matrigel膠的Transwell小室，取200 μl各組Calu細胞懸液添加至上室，取適量含20%FBS的RPMI1640培養液于下室，培養24 小時，PBS緩沖液沖去上室殘留細胞后用多聚甲醛固定(20 分鐘)，結晶紫染色、干燥，顯微鏡拍照并計數侵襲細胞數。將Calu細胞接種于6孔板并培養至細胞融合率達到90%，用槍頭在6孔板底部作劃痕，培養24小時，顯微鏡下觀察并分析細胞遷移能力，計算劃痕愈合率。劃痕愈合率(%)=(0小時劃痕寬度-24小時劃痕寬度)/0小時劃痕寬度×100%。

7.肺癌細胞Calu中CCND2、凋亡、侵襲相關蛋白測定：用高效RIPA裂解液提取Calu細胞中總蛋白質，用BCA蛋白測定試劑盒測定蛋白質含量，經SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉膜、封閉(1 小時)后，加入兔源CCDN2、Caspase-3、Bax、Bcl-2、MMP-2、MMP-9、GAPDH一抗，低溫孵育過夜，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗，室溫孵育1 小時，顯色、曝光、凝膠成像儀觀察并分析條帶。

8.miR-367-3p與CCND2靶向關系驗證：Targetscan數據庫查詢miR-367-3p和CCDN2結合位點，構建突變型(CCDN2-MUT)、野生型(CCDN2-WT)熒光素酶表達載體，將CCDN2-MUT、CCDN2-WT分別與miR-367-3p mimic NC、miR-367-3p mimic共轉染至Calu細胞中，培養24 小時后測定各組Calu細胞的相對熒光素酶活性，實驗重復3次。

三、統計學分析

結 果

1.各細胞中miR-367-3p表達水平比較：與人正常肺細胞HLF-a相比，人肺癌細胞Calu、MSTO-211H、NCI-H2347、NCI-H1437、NCI-H1944、NCI-H647中miR-367-3p表達水平顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)。其中，Calu細胞中miR-367-3p表達相對較低(表1)，因此選取Calu細胞用于后續研究。

表1 各細胞中miR-367-3p表達水平比較

2.各組肺癌細胞Calu中miR-367-3p、CCND2表達水平比較：與對照組比較，miR-367-3p NC組miR-367-3p、CCND2差異無統計學意義(P>0.05)，miR-367-3p mimic組Calu細胞中miR-367-3p表達顯著升高，CCND2蛋白表達顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)；與miR-367-3p mimic組相比，miR-367-3p mimic+pc-CCND2組Calu細胞中CCND2蛋白表達顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組Calu細胞中miR-367-3p及CCND2表達水平比較

3.各組肺癌細胞Calu細胞活力比較：與對照組比較，miR-367-3p NC組Calu細胞活力差異無統計學意義(P>0.05)，miR-367-3p mimic組Calu細胞活力顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)；與miR-367-3p mimic組比較，miR-367-3p mimic+ pc-CCND2組Calu細胞活力顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 各組Calu細胞的細胞活力比較

4.各組肺癌細胞Calu凋亡情況比較：與對照組比較，miR-367-3p NC組Calu細胞凋亡率、Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表達差異無統計學意義(P>0.05)，miR-367-3p mimic組Calu細胞凋亡率、Caspase-3、Bax蛋白表達顯著升高，Bcl-2蛋白表達顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)；與miR-367-3p mimic組比較，miR-367-3p mimic+pc-CCND2組Calu細胞凋亡率、Caspase-3、Bax蛋白表達顯著降低，Bcl-2蛋白表達顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 各組Calu細胞凋亡情況比較

5.各組肺癌細胞Calu侵襲、遷移情況比較：與對照組相比，miR-367-3p NC組侵襲、遷移能力、MMP-2、MMP-9蛋白表達差異無統計學意義(P>0.05)，miR-367-3p mimic組Calu細胞侵襲、遷移能力、MMP-2、MMP-9蛋白表達顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)；與miR-367-3p mimic組比較，miR-367-3p mimic+pc-CCND2組Calu細胞侵襲、遷移能力、MMP-2、MMP-9蛋白表達顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見表5。

表5 各組Calu細胞侵襲、遷移情況比較

6.miR-367-3p與CCND2靶向關系測定：TargetScan數據庫結果顯示，miR-367-3p在CCND2的3'-UTR區存在相應結合位點(圖1)；熒光素酶實驗顯示，與CCND2 WT+miR-367-3p NC組(1.00±0.08)相比，CCND2 WT+miR-367-3p mimic組Calu細胞熒光素酶活性(0.43±0.07)顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)，CCND2 MUT+miR-367-3p NC組(0.99±0.10)及CCND2 MUT+miR-367-3p mimic組(1.01±0.13)差異無統計學意義(P<0.05)。

圖1 miR-367-3p和CCND2的3'-UTR區序列相互結合

討論

目前，肺癌常用的治療手段有手術切除、放化療、分子靶向治療、藥物治療等。肺癌的治療已取得較大進展，但由于肺癌就診時多為晚期，大多數病人的生存質量及預后仍不理想[6-7]。miRNA是近年來發現的參與肺癌等多種惡性腫瘤發生及發展的內源性非編碼單鏈RNA，主要通過與靶基因的3'-UTR區配對來調節靶基因的表達，進而發揮相應的促癌、抑癌作用[2]。miR-367-3p是miRNA302-367家族成員，近年來的研究發現，miR-367-3p與肺癌等多種腫瘤細胞的增殖、遷移活動聯系密切[8]，萬亮[3]研究發現，miR-367-3p在非小細胞肺癌細胞中表達低于正常肺上皮細胞，Yu等[9]研究發現，提高miR-367-3p的表達可顯著抑制非小細胞肺癌細胞的增殖和遷移。本研究結果顯示，人肺癌細胞Calu、MSTO-211H、NCI-H2347、NCI-H1437、NCI-H1944、NCI-H647中miR-367-3p表達水平顯著低于人正常肺細胞HLF-a，其中Calu細胞中miR-367-3p表達相對較低，因此選取Calu細胞用于后續轉染實驗。轉染實驗結果顯示，miR-367-3p NC組與對照組相比miR-367-3p及CCND2蛋白表達大致相同，miR-367-3p mimic組miR-367-3p表達顯著高于對照組，miR-367-3p mimic+pc-CCND2組Calu細胞中CCND2蛋白表達顯著高于對照組，提示實驗轉染效果較好。

惡性增殖、侵襲、轉移是惡性腫瘤導致病人分期較高、預后較差、死亡率高的主要原因，腫瘤的惡性程度越大，細胞的侵襲、轉移能力越強，鄰近的正常組織越易被侵犯，最終導致腫瘤面積擴大[10]。因此，探究miR-367-3p對肺癌細胞增殖、遷移能力的影響具有重要意義。Caspase-3、Bax為重要的促凋亡因子，Bax主要通過增強Caspase-3水平發揮作用，Bcl-2是重要的抗凋亡因子，具有阻止細胞凋亡的作用，測定細胞中Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表達水平可間接反映細胞的凋亡能力[11]。MMP-2、MMP-9與腫瘤細胞的侵襲、遷移活動聯系密切，是MMPs家族成員，測定細胞中MMP-2、MMP-9蛋白表達水平可反映細胞的侵襲、遷移能力[12]。本研究結果顯示，提高miR-367-3p表達，可顯著降低Calu細胞的細胞活力及侵襲、遷移能力，降低細胞中MMP-2、MMP-9、Bcl-2蛋白表達，提高細胞凋亡率及細胞中Caspase-3、Bax蛋白表達水平，提示miR-367-3p高表達可顯著降低肺癌細胞Calu的增殖及遷移能力，并促進其凋亡，但其機制仍不清晰。

CCND2是D型細胞周期蛋白cyclin蛋白家族成員，與肺癌等腫瘤細胞的增殖、轉移活動聯系密切。Jin等[13]研究發現，上調CCND2表達可促進非小細胞肺癌的發生及發展。多項研究表明，miRNA可靶向調節CCND2參與非小細胞肺癌的生長和轉移過程。Yao等[14]研究發現，miR-671-3p可靶向抑制CCND2抑制非小細胞肺癌的發展。He等[15]研究發現，miR-4317可靶向抑制CCND2抑制非小細胞肺癌的遷移及侵襲，提高CCND2表達后可減弱miR-4317的抑制作用。Targetscan預測結果顯示miR-367-3p與CCND2的3'-UTR區存在相應的結合位點，熒光素酶活性實驗結果顯示miR-367-3p過表達能顯著下調野生型CCND2-3'UTR熒光素酶活性，表明miR-367-3p可直接靶向調節CCND2的表達，并且，CCND2過表達可逆轉miR-367-3p過表達對Calu細胞活力、侵襲、遷移能力的抑制作用。提示miR-367-3p抑制肺癌細胞Calu的增殖、遷移能力可能是通過抑制CCND2表達實現的。

綜上所述，miR-367-3p過表達可抑制肺癌細胞Calu的增殖、遷移能力，可能是通過靶向抑制CCND2實現的。本研究存在不足之處，由于條件及時間限制，未做動物實驗進一步驗證研究結果。