響應面優(yōu)化微波協(xié)同雙水相體系提取咖啡豆中綠原酸的工藝研究

◎ 鄭 琰，趙麗娟

（普洱學院，云南 普洱 665000）

咖啡是眾多消費者喜愛的飲品，其營養(yǎng)價值一直備受關(guān)注，尤其是咖啡豆中所含的大量多酚類化合物已成為關(guān)注的重點[1]?？Х榷怪械幕钚晕镔|(zhì)極其豐富，綠原酸是其主要生物活性成分之一，具有降血壓、抗氧化、抗病毒、清除自由基等功效，常應用于食藥、化工等行業(yè)[2-4]。綠原酸在不同的植物中含量不同，以杜仲葉、蒲公英、葵花籽、咖啡豆中綠原酸類似物的含量較高[5-7]。綠原酸在新鮮咖啡豆中含量占2%～8%，烘焙過后含量會因發(fā)生美拉德反應、焦糖化等化學反應降低。

目前國內(nèi)以咖啡豆作為研究對象提取綠原酸的工藝研究相對較少，云南咖啡年產(chǎn)量位居全國前列，對咖啡豆中綠原酸提取工藝進行研究，提高綠原酸的產(chǎn)率具有很大的研究意義，有必要探究適合于云南咖啡豆中綠原酸提取的有效方法。相較于傳統(tǒng)單一的溶劑提取技術(shù)，微波技術(shù)作為一種新發(fā)展起來的加熱技術(shù)，具有提取速度快、對樣品破壞小、體系受熱均勻等特點[8-9]。作為新型的溶劑萃取分離技術(shù)，雙水相萃取根據(jù)組分在兩相間的選擇性分配從而達到目標成分分離的目的，提取過程中能有效保護目標成分的生物活性，并且雙水相萃取操作簡單、反應速度快、選擇性強、成本低、破壞小，對于天然活性物質(zhì)的分離純化，其效率更高，并且不會殘留有機溶劑造成危害[10-12]。雙水相萃取體系，若加以微波輔助，能有效提高提取率、減少反應時間和萃取成本，并且安全、環(huán)保[13-16]。

本文根據(jù)雙水相的特點，采用微波技術(shù)協(xié)同乙醇-磷酸氫二鉀雙水相體系提取云南小粒咖啡豆中的綠原酸，并采用響應面法優(yōu)化提取體系，為云南小粒咖啡中綠原酸的提取奠定理論基礎，為咖啡豆中的綠原酸資源利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

試劑：無水乙醇（分析純，天津市致遠化學試劑有限公司）；磷酸氫二鉀（分析純，天津市風船化學試劑科技有限公司）；綠原酸標準品（中國食品藥品檢定研究院）。

儀器：紫外-可見分光光度計[UV-2600，島津企業(yè)管理（中國）有限公司]；格蘭仕微波爐（P70F20CN3LHP3，廣東格蘭仕微波生活電器制造有限公司）。

咖啡豆樣品：購于云南某咖啡公司，用蒸餾水將咖啡豆洗凈，烘干，取出后粉碎成粉末，過30 目篩，裝袋密封備用。

1.2 實驗方法

1.2.1 綠原酸標準溶液的配制

分別準確移取不同體積的100 μg·mL-1綠原酸標準儲備液配制成濃度為0 μg·mL-1、1.00 μg·mL-1、2.00 μg·mL-1、5.00 μg·mL-1、8.00 μg·mL-1、10.00 μg·mL-1的標準溶液，在331 nm 波長處測定吸光度值，繪制標準曲線。

1.2.2 咖啡豆綠原酸含量的測定

按一定比例配制乙醇-磷酸氫二鉀雙水相體系，加入準確稱取的咖啡豆粉末樣品，在一定微波功率下加熱萃取，離心，取上清液稀釋定容，在331 nm 波長下測其吸光度，代入標準曲線方程，得到樣品溶液中綠原酸濃度，按下式計算出樣品的綠原酸提取率。

式中：X為綠原酸的提取率，%；c為樣品中綠原酸濃度，μg·mL-1；V為樣液體積，mL；n為提取液的稀釋倍數(shù)；m為樣品質(zhì)量，g。

1.2.3 單因素實驗

準確稱取咖啡粉末樣品1.000 0 g，在固定其他因素不變的條件下，分別探討不同乙醇體積分數(shù)（60%、65%、70%、75%、80%、85%）、不同磷酸氫二鉀質(zhì)量濃度（0.1 g·mL-1、0.2 g·mL-1、0.3 g·mL-1、0.4 g·mL-1、0.5 g·mL-1、0.6 g·mL-1）、不同料液比（1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50、1 ∶60、1 ∶70）、不同微波功率（210 W、280 W、350 W、420 W、490 W、700 W）、不同微波時間（10 s、15 s、20 s、25 s、30 s、35 s）對小粒咖啡綠原酸提取效果的影響，并按照1.2.2方法進行測定，計算綠原酸提取率。

1.2.4 響應面優(yōu)化實驗設計

本研究采用Design Expert 8.0.6.1 軟件，以乙醇體積分數(shù)、磷酸氫二鉀質(zhì)量濃度、料液比、微波時間為變量值，以綠原酸提取率為響應值，建立模型，進行優(yōu)化實驗，通過對響應曲面圖和等高線圖進行分析，以獲取優(yōu)化參數(shù)，因素水平見表1。

表1 響應面實驗設計因素水平表

2 結(jié)果與分析

2.1 綠原酸標準曲線的繪制

如圖1 所示，綠原酸標準曲線的線性回歸方程為y=0.055 9x-0.004 1，相關(guān)系數(shù)值為0.999 7，說明線性關(guān)系良好，標準曲線可用于后續(xù)數(shù)據(jù)分析研究，結(jié)果可靠。

圖1 綠原酸標準曲線圖

2.2 單因素實驗結(jié)果

2.2.1 乙醇體積分數(shù)

根據(jù)單因素實驗設計進行實驗，由圖2 可知，當乙醇體積分數(shù)達到75%時，咖啡豆綠原酸提取率得到最大值，為4.05%，故初步選取75%為最佳乙醇體積分數(shù)。

圖2 乙醇體積分數(shù)對綠原酸提取率的影響

2.2.2 磷酸氫二鉀質(zhì)量濃度

由圖3 可知，磷酸氫二鉀質(zhì)量濃度在0.2 g·mL-1時達到最大值4.09%，故初步選取0.2 g·mL-1為最佳磷酸氫二鉀質(zhì)量濃度。

圖3 磷酸氫二鉀質(zhì)量濃度對綠原酸提取率的影響

2.2.3 料液比

由圖4 可知，咖啡豆綠原酸提取率在一定的料液比條件范圍內(nèi)波動，當物料與溶劑的比例在1 ∶50（g ∶mL）時，提取率達到在此范圍內(nèi)的最大值4.26%，而后逐步降低，故初步選取1 ∶50（g ∶mL）為最佳料液比。

圖4 料液比對綠原酸提取率的影響

2.2.4 微波功率

由圖5 可知，微波功率在210 ～280 W，咖啡豆中綠原酸的提取率急劇增加，于280 W 達到最大值4.33%，故初步選取280 W 為最佳微波功率。

圖5 微波功率對綠原酸提取率的影響

2.2.5 微波時間

由圖6 可知，微波時間在10 ～15 s 內(nèi)，咖啡豆綠原酸的提取率急劇升高且在15 s 時達到了整個時間研究范圍內(nèi)的最大值4.44%。故初步選取15 s 為最佳微波時間。

圖6 微波時間對綠原酸提取率的影響

綜上所述，初步選取75% 乙醇體積分數(shù)、0.2 g·mL-1磷酸氫二鉀質(zhì)量濃度、1 ∶50 料液比、280 W 微波功率、15 s 微波時間的工藝條件用于后續(xù)優(yōu)化研究。

2.3 響應面實驗結(jié)果

2.3.1 響應面實驗設計方案及結(jié)果

根據(jù)單因素實驗的結(jié)果，以咖啡豆中綠原酸提取率為因變量，乙醇體積分數(shù)（A）、磷酸氫二鉀質(zhì)量濃度（B）、料液比（C）、微波時間（D）4 個因素為自變量，設計響應面分析水平實驗，設計水平見表1，優(yōu)化咖啡豆中綠原酸的提取條件。按照軟件所設計的各因素條件進行試驗，如表2 所示，計算出相應綠原酸提取率。

表2 響應面實驗設計及結(jié)果表

2.3.2 回歸方程和方差分析

利用Design Expert 8.0.6.1 軟件進行多元回歸方程擬合方差分析，得到綠原酸的提取率（響應值E）的回歸方程為

E=4.48+0.080A-0.046B+0.061C+0.11D-0.078AB+0.013AD-0.043BC+0.067BD+0.030CD-0.15A2-0.026B2-0.076C2-0.17D2

由表3 可知，本實驗模型的F值為28.52；回歸方程達到顯著（P值＜0.000 1），決定系數(shù)R2=0.932 2，說明回歸模型可靠。由表中的F值的大小可以看出這4 個因素對綠原酸提取率影響程度為微波時間＞乙醇體積分數(shù)＞料液比＞磷酸氫二鉀質(zhì)量濃度。

表3 回歸方程的方差分析表

2.3.3 響應面圖分析

響應面圖中圖形曲面坡度的大小、等高線的形狀和密集程度能直觀反映出兩個單因素之間的交互作用大小[17]。各個因素之間的交互作用對綠原酸提取率的影響見圖7 和圖8，可以據(jù)此分析4 個單因素的交互作用。

圖7 所示為乙醇體積分數(shù)分別與磷酸氫二鉀質(zhì)量濃度、料液比、微波時間兩兩之間對咖啡豆中綠原酸提取率的交互影響。①比較乙醇體積分數(shù)與磷酸氫二鉀濃度的交互影響可知，隨著乙醇體積分數(shù)的增加，綠原酸的提取率變化幅度更大，說明乙醇體積分數(shù)相較于磷酸氫二鉀質(zhì)量濃度對響應值的影響更為顯著。②在乙醇體積分數(shù)與料液比兩個因素的交互影響圖中，咖啡豆綠原酸提取率隨乙醇體積分數(shù)變化的曲面較料液比變化曲面陡峭，說明乙醇體積分數(shù)的影響大于料液比的影響。③比較乙醇體積分數(shù)與微波時間兩個因素的交互影，綠原酸提取率隨兩因素條件的變化均呈先增加后減小的趨勢，微波時間對響應值的影響較乙醇體積分數(shù)稍大。

圖7 乙醇體積分數(shù)與其他因素的兩兩交互影響圖

圖8 所示為料液比、微波時間、磷酸氫二鉀質(zhì)量濃度3 個因素兩兩之間對咖啡豆中綠原酸提取率的交互影響。比較3 個因素對咖啡豆中綠原酸提取率的兩兩交互影響，可知料液比對咖啡豆中綠原酸提取率的影響大于磷酸氫二鉀質(zhì)量濃度；微波時間對咖啡豆綠原酸提取率的影響明顯大于磷酸氫二鉀質(zhì)量濃度的影響；微波時間對咖啡豆綠原酸提取率的影響大于料液比的影響。

圖8 料液比、微波時間、磷酸氫二鉀質(zhì)量濃度3 個因素的兩兩交互影響圖

綜上所述，通過比較4 個因素相互作用，它們對咖啡豆中綠原酸的提取率影響大小排列順序結(jié)果與回歸方程的方差分析表結(jié)果一致，微波時間對咖啡豆綠原酸提取率的影響最大，磷酸氫二鉀質(zhì)量濃度的影響最小。

2.3.4 實驗條件的優(yōu)化、預測和驗證

用Design-Expert 8.0.6.1 軟件進行分析，能夠得到提取云南小?？Х榷咕G原酸的最優(yōu)工藝條件，以及最佳提取率的預測值，為了證明響應面優(yōu)化結(jié)果的準確度，在最佳預測條件下進行驗證實驗，得到綠原酸平均提取率為4.55%，驗證值與預測值4.54%相近，證明最佳預測條件下的工藝條件是合理的。

3 結(jié)論

本文研究了微波輔助乙醇-磷酸氫二鉀雙水相體系提取云南小?？Х榷怪芯G原酸的工藝條件，在單因素實驗的基礎上，用Box-Behnken 響應面優(yōu)化法設計模型，進行線性回歸方程和二項式擬合，得到提取云南小?？Х染G原酸的最佳工藝條件為乙醇體積分數(shù)為76.98%，磷酸氫二鉀質(zhì)量濃度為0.14 g·mL-1，料液比為1 ∶54.97，微波功率為280 W，微波時間為15.48 s；在該優(yōu)化條件下得到的云南小粒咖啡豆中綠原酸提取率為4.54%，與預測值4.55%相近，說明該方法對提取咖啡豆中的綠原酸效果顯著，本研究方法采用微波輔助乙醇-磷酸氫二鉀雙水相體系提取云南小?？Х榷怪芯G原酸具有一定可行性，為云南小粒咖啡中綠原酸的提取及相關(guān)資源開發(fā)利用提供一定理論參考。