傳統發酵和工業生產黃豆醬中風味物質的差異分析

◎ 張 曉，葛 謙，賈 航，曾雪君，岳田利,4，袁亞宏,4

（1.蘇州農業職業技術學院 食品科技學院，江蘇 蘇州 215008；2.寧夏農產品質量標準與檢測技術研究所，寧夏 銀川 750002；3.西北農林科技大學 食品科學與工程學院，陜西 楊凌 712100；4.西北大學 食品科學與工程學院，陜西 西安 710069）

黃豆醬在我國已經有3 000 多年的歷史，因其在烹飪中可以顯著提高食品的鮮味，在東亞和東南亞國家深受消費者喜愛[1]。黃豆醬不僅含有豐富的有機酸、氨基酸、礦物質和微生物等營養物質[2]，還具有抗炎[3]、抗肥胖[4]和抗癌的功效[5]。

生產豆醬的原料、種曲、發酵條件及加工工藝對最終產品的風味和品質都有重要影響[6]。傳統發酵黃豆醬是以黃豆、淀粉為主要原料，采用自然接種的方式進行制醅，經過2 ～3 個月自然發酵成熟[7]。工業生產黃豆醬多采用人工接種、控溫發酵的方式進行，生產周期短，產品一致性較高，但由于發酵菌種單一、發酵時間短，存在風味單一、滋味濃厚度不足等問題。

有機酸、氨基酸、核苷酸、脂肪酸等相對分子量較低的非揮發性化合物是構成黃豆醬特殊風味的重要味覺因子[8]，這些化合物部分來源于生產黃豆醬所使用的原料（如大豆、小麥、曲霉等），另一部分來源于生產過程中的酶促反應和熱降解。同時，發酵和貯存過程中微生物代謝、原料水解產生的有機酸和氨基酸是醇類、酯類和醛類等揮發性風味物質的前體，對黃豆醬獨特的風味及口感形成有重要作用[9]。為了探究不同加工工藝對黃豆醬品質的影響，本研究采集了東北地區家庭傳統發酵和工業生產黃豆醬樣品共49份，采用高效液相色譜和固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用技術對其有機酸、氨基酸和揮發性風味物質含量進行測定，并通過統計分析獲得導致其品質差異的主要物質，為進一步探究傳統發酵黃豆醬特殊風味的來源及工業生產黃豆醬品質提高提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗所用的49 份黃豆醬樣品均采自東北地區，其中13 份采自工廠（編號C1-C13），其余36 份樣品采自農戶（編號T1-T36），樣品分布地區和類型如表1所示。所有樣品均由黃豆及小麥粉作為主要原料制成，樣品在分析前保存在4 ℃冰箱。

表1 黃豆醬樣品采集地區分布及數量表

色譜乙腈、甲醇，美國天地公司；磷酸、磷酸銨、三氯乙酸、鹽酸，色譜純，上海生工；磷酸氫二鈉、四硼酸鈉，分析純，上海阿拉??；有機酸標準品，上海源葉；氨基酸標準品，日本島津。

1.2 儀器與設備

LC-20A 高效液相色譜，日本島津；QP2010 氣相色譜質譜聯用儀，日本島津；GTR 16-2 高速冷凍離心機，北京時代北利離心機有限公司；超純水機，南京軒科儀器公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 有機酸含量的測定

①樣品預處理。取破碎均勻的樣品5 g，加蒸餾水定容至50 mL，超聲提取10 min，10 000×g離心10 min，取上清液2 mL，加入1 mol·L-1磷酸0.08 mL，蒸餾水定容到4 mL。②儀器測定。采用高效液相色譜法進行測定，色譜柱為Shimi-pack VP-DOS C18分析柱（250 mm×4.6 mm，4.5 μm，日本島津）。分析條件：流速0.7 mL·min-1，溫度40 ℃，流動相0.01 mol·L-1磷酸銨（磷酸調節pH 值至2.7），PDA 檢測器檢測[10]。

1.3.2 氨基酸含量的測定

①樣品預處理。取破碎均勻的樣品5 g，加蒸餾水定容至50 mL，超聲提取10 min，10 000×g 離心10 min，取上清液進行進一步分析。②儀器測定。采用高效液相色譜按照日本島津氨基酸分析試劑盒（PN:AJS-01）的方法進行分析[11]。取樣品濾液2 mL，加入5%三氯乙酸溶液5 mL，混勻，靜置60 min，蒸餾水定容至10 mL，離心5 min，上清液用0.22 μm濾膜過濾，進行高效液相色譜分析。日本島津高效液相色譜系統，配有LC-20AD 泵，SIL-20A 自動進樣器，CTO-20A 柱箱，SPD-M20A 紫外/可見檢測器，Durashell AA 分析柱（150 mm×4.6 mm，3 μm），柱溫50 ℃。流動相A 為0.45% Na2HPO4·12H2O 和0.475%Na2B4O7·10H2O，用36%鹽酸調節pH 值為8.2；流動相B為甲醇-乙腈-去離子水(45∶45∶10，v∶v∶v)。梯度洗脫程序見表2，所有樣品進樣量均為2 μL。紫外檢測波長為338 nm 和262 nm，檢出限均為1 mg·L-1。

表2 氨基酸HPLC 分析梯度洗脫程序表

1.3.3 揮發性物質分析

采用固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用技術對所有大豆醬樣品進行揮發性成分分析[10]。將2 g 黃豆醬樣品放入20 mL 玻璃小瓶中，加入40 μL 的2-辛醇（最終濃度4.09×104μg·L-1）作為內標。采用固相微萃取取樣器，采用carboxen/二乙烯基苯/聚二甲基硅氧烷纖維（美國色譜科公司），將揮發性化合物在相同溫度下富集15 min 后，在頂空40 ℃萃取20 min。將進樣器插入氣相色譜儀進樣器中，在250 ℃無分流進樣模式下熱解吸3 min。采用氣相色譜-質譜聯用儀對揮發性化合物進行鑒定和定量。采用DB-1 MS 色譜柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm）進行分析，溫度程序為40 ℃，保持3 min，4 ℃·min-1升溫至120 ℃，然后6 ℃·min-1升溫至240 ℃，保持9 min。1.3.4 數據分析

試驗均重復測定3 次。采用SPSS 統計軟件包version 22 進行獨立樣本t檢驗和非參檢驗，p＜0.05 為樣本間有顯著差異；采用SIMCA 14.1 軟件正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA），作圖采用OriginPro 2017。

2 結果與分析

2.1 傳統發酵和工業生產黃豆醬中有機酸和氨基酸的差異分析

2.1.1 有機酸

有機酸是黃豆醬呈現酸味的主要原因，黃豆醬中的糖酸比決定了產品的酸甜口感。研究表明，發酵醬類食品中的有機酸主要為草酸、酒石酸、丙酮酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸和琥珀酸等[8]。圖1 所示為傳統發酵黃豆醬和工業生產黃豆醬中8 種主要有機酸的含量對比，可以發現乳酸、乙酸和蘋果酸是黃豆醬中主要的有機酸，草酸、酒石酸、檸檬酸、琥珀酸和丙酮酸的含量較低。丙酮酸是三羧酸循環的重要原料，也是參與形成氨基酸的原料[12]，因此在樣品中很難被檢測到。傳統發酵黃豆醬中的有機酸含量顯著高于工業生產黃豆醬，其中乳酸、乙酸、蘋果酸和檸檬酸的平均含量分別達到4.49 mg·g-1、2.53 mg·g-1、1.37 mg·g-1和1.08 mg·g-1。工業生產黃豆醬中含量最高的有機酸為乳酸（1.53 mg·g-1），其次為酒石酸（1.10 mg·g-1）和乙酸（0.54 mg·g-1）。這可能是由于傳統黃豆醬采用混合菌種發酵，乳酸菌和乳酸桿菌的代謝活性更高[13-14]，并且發酵周期長，積累了更多酸類物質[15]。

圖1 傳統發酵（T）和工業生產（C）黃豆醬有機酸含量圖

2.1.2 氨基酸

氨基酸對發酵食品的味道有著至關重要的作用，依據氨基酸呈現出味道的不同，可以分為4 類。呈現鮮味的谷氨酸、天冬氨酸，呈現甜味的絲氨酸、脯氨酸、甘氨酸、蘇氨酸和丙氨酸，呈現苦味的纈氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、亮氨酸、精氨酸、組氨酸和酪氨酸，以及對味道沒有貢獻的半胱氨酸[8,12,16]。采用高效液相色譜對傳統發酵黃豆醬和工業生產黃豆醬樣品中的17 種氨基酸進行了分析，結果如圖2 所示。傳統發酵黃豆醬中氨基酸總量平均值為26.96 mg·g-1，略低于工業生產黃豆醬（31.56 mg·g-1）。脯氨酸在兩種黃豆醬中的含量最高，在工業生產黃豆醬中達到4.99 mg·g-1，傳統發酵樣品中為3.93 mg·g-1；其次為谷氨酸，在兩類樣品中的平均含量分別為4.59 mg·g-1和3.73 mg·g-1；丙氨酸和亮氨酸的含量也相對較高。鮮味氨基酸在工業生產黃豆醬的含量高于傳統發酵氨基酸樣品，可能是由于工業生產過程中添加了鮮味氨基酸進行調味。樣品中半胱氨酸、甲硫氨酸、組氨酸和酪氨酸的含量極低，對風味的影響較小。

圖2 傳統發酵（T）和工業生產（C）黃豆醬游離氨基酸含量圖

從兩類樣品中有機酸和氨基酸含量的分析中不難發現，即使同組樣品中其含量也有較大差異，這是由于黃豆醬生產過程中原料、發酵微生物和發酵條件均會對產品的風味產生影響[13]；尤其是傳統發酵黃豆醬，由于每家每戶所采用的原料、發酵工藝均不盡相同，導致最終產品的差異較大，這也是傳統發酵黃豆醬風味多樣的來源。

2.1.3 有機酸和氨基酸的差異分析

采用OPLS-DA 分析傳統發酵黃豆醬和工業生產黃豆醬中的關鍵滋味物質，并進一步研究這些非揮發性化合物與不同工藝之間的關系。在OPLS-DA 模型中，將樣品中26 種有機酸和氨基酸含量指定為x矩陣，樣品指定為y矩陣。從圖3 中可看出，兩類黃豆醬樣品的分布有明顯差異，傳統發酵黃豆醬樣品主要分布在x軸的負半軸，分布較分散；而工業生產黃豆醬分布在x軸的正半軸區域，分布較為集中，說明其有機酸和氨基酸含量一致性較高。

圖3 氨基酸、有機酸含量與樣品的OPLS-DA 分析雙標圖

為了進一步明確傳統發酵黃豆醬和工業生產黃豆醬中的關鍵差異物質，對樣品中有機酸和氨基酸的VIP值進行計算，化合物的VIP 值如圖4 所示，通常VIP值大于1 的化合物被認為是對樣品間差異有重要貢獻。從圖4 中可以看出乳酸、乙酸、谷氨酸、蘋果酸、天冬氨酸、丙氨酸、精氨酸、絲氨酸和檸檬酸的VIP 值大于1，說明傳統發酵和工業生產黃豆醬中的這9 種非揮發性物質可能是造成兩類黃豆醬味道差異的關鍵化合物。結合有機酸和氨基酸含量分析結果，可推測乳酸、乙酸、谷氨酸、蘋果酸和丙氨酸是導致傳統發酵和工業生產黃豆醬風味差異的主要非揮發性物質。

圖4 傳統發酵和工業生產黃豆醬風味差異貢獻VIP 成分圖

2.2 傳統發酵和工業生產黃豆醬中揮發性風味物質的差異分析

在傳統發酵和工業生產黃豆醬樣品中共檢測到203 種揮發性風味化合物，被分為10 類，包括60 種酯、37 種醇、19 種醛、19 種酮、18 種萜烯、17 種酸、14 種呋喃（酮）、8 種酚、7 種吡嗪和4 種含硫化合物。其中，傳統發酵黃豆醬中檢測到揮發性風味化合物162 種，高于工業生產黃豆醬中的108 種。這些化合物均在之前的研究中被報道為醬油或豆醬的風味化合物[17-20]。各類揮發性風味化合物的相對濃度如表3 所示，傳統發酵黃豆醬中揮發性風味化合物的平均含量為23 979.3 μg·kg-1，顯著高于工業生產黃豆醬。傳統發酵黃豆醬中酯類化合物含量最高，平均值達到11 346.3 μg·kg-1，其次為醇類、酸類和醛類；工業生產黃豆醬中醇類化合物含量最高，其次為酯類、醛類和酸類。其中，醇類、酯類、酸類、酮類、烯萜類和呋喃（酮）類的相對濃度在傳統發酵和工業生產黃豆醬中存在顯著差異。傳統發酵黃豆醬中酯類、酸類和酮類的含量顯著高于工業生產黃豆醬，這可能是由于傳統黃豆醬的發酵周期更長，有研究表明醬類發酵和貯存過程有利于脂肪酸乙酯類化合物的積累[21]。工業生產黃豆醬中醇類、萜類和呋喃（酮）類的含量顯著高于傳統發酵黃豆醬，這是由于工業生產黃豆醬為了提高產品風味、延長貨架期，在發酵結束后普遍存在加熱工序，促進了呋喃（酮）類、斯托克醛、含硫化合物和α-二羰基化合物等風味化合物的產生[18,22]。

表3 傳統發酵和工業生產黃豆醬中揮發性風味物質含量表

黃豆醬是以黃豆、淀粉為主要原料，經過霉菌、酵母菌和乳酸菌等多種微生物協同發酵而成的，其發酵過程主要包括制曲和醬醅發酵兩個階段，發酵品質的優劣是決定產品風味的關鍵因素。傳統黃豆醬采用日曬夜露的方式進行發酵，發酵溫度受天氣變化影響大，顯著影響了美拉德反應和微生物的代謝活動[19]；與工業生產過程相比，其發酵條件溫和、緩慢，有利于揮發性風味物質的積累。另外，工業生產黃豆醬通過添加單一或幾種微生物進行發酵[23]，而傳統黃豆醬采用自然接種的方式進行制曲發酵，豐富的微生物群落是其多樣的風味物質產生的來源[24-25]。因此，傳統發酵黃豆醬中的揮發性風味物質種類及含量更加豐富，為其風味的獨特性和多樣性提供了物質基礎。

非揮發性化合物是構成食品味覺的重要因素，也是導致不同食品味道差異的主要原因，它們主要與5 種類別的味覺有關：甜、咸、酸、苦和鮮味[8]。谷氨酸是公認的鮮味化合物，味精（谷氨酸鈉）在日常烹飪中經常作為鮮味添加劑使用。其他的一些鮮味化合物包括天冬氨酸、核苷酸等在發酵醬類食品中也天然存在，有研究發現優質醬油中的味覺活性氨基酸和核苷酸化合物的含量更高[26]。有機酸類是食品酸味的來源，KONG 等[8]研究發現，乳酸和焦谷氨酸是中式醬油中主要的有機酸，有助于增加酸味，保證了醬油口感的平衡。另外，丙氨酸、甘氨酸、絲氨酸呈現類似糖類的甜味，在黑醬油和日本醬油中含量更高。本研究中發現傳統黃豆醬中的乳酸、乙酸和丙氨酸的含量顯著高于工業生產黃豆醬，這可能是傳統黃豆醬口感更加濃厚、平衡的原因之一。

揮發性化合物在食品風味中的重要性和作用方式已經被廣泛報道，醬類中的揮發性化合物含量特別豐富，研究人員已在不同類型的醬類食品中發現超過300 種具有香氣活性的揮發性化合物，其中許多都與醬類的主要香氣有關：醛類是麥芽香氣的主要來源，酮類則主要呈現焦糖味，而醇類、酯類是花香味和果香味的主要來源[13]。2-苯乙醇有玫瑰般的香氣，是與醬類花香有關的主要化合物之一，主要在傳統發酵過程中由丙氨酸在酵母的代謝過程中產生的，當醬醪的發酵周期較長時就更加豐富[27]。醬類中最豐富的酯類是2-甲基丙酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯和3-甲基乙酸丁酯，它們會帶來甜味和水果味，酯類與酵母的酯類代謝有關，酵母代謝產生大量的酸和醇類，這些酸和醇類隨后發生酯化反應生成酯類[13]。FENG 等[28]研究發現，延長發酵醬的陳化期有助于積累更加豐富的酯類物質。傳統黃豆醬采用自然接種的方式制曲，發酵菌種更加豐富，是其產生多樣風味的重要原因。

3 結論

研究發現，傳統發酵黃豆醬中的有機酸含量顯著高于工業生產黃豆醬，尤其是乳酸（4.49 mg·g-1）、乙酸（2.53 mg·g-1）和蘋果酸（1.37 mg·g-1）；氨基酸總量平均值為26.96 mg·g-1，略低于工業生產黃豆醬（31.56 mg·g-1），脯氨酸、谷氨酸在兩類黃豆醬中均為含量最高的氨基酸；傳統發酵黃豆醬中揮發性風味化合物的平均含量為23 979.3 μg·kg-1，高于工業生產黃豆醬（17 672.3 μg·kg-1），其中酯類、酸類和酮類的含量顯著高于工業生產黃豆醬；統計分析結果表明乳酸、乙酸、谷氨酸、蘋果酸、丙氨酸、醇類、酯類和酸類可能是導致傳統發酵和工業生產黃豆醬風味差異的主要物質，為進一步探究傳統發酵黃豆醬特殊風味的來源及工業生產黃豆醬品質提高提供參考。