基于網絡藥理學探討滋腎活絡方改善高血壓左室肥大的物質基礎和作用機制

吳智春 于華蕓 宋曉彤 王媛 王華 王志宏

(1山東中醫藥大學中醫學院，山東 濟南 250355；2山東省中醫經典名方協同創新中心；3山東中醫藥 大學附屬醫院老年醫學科)

高血壓是中國面臨的重要公共衛生問題，高血壓左室肥大是心臟事件的獨立危險因素，與心律失常、猝死和心力衰竭密切相關〔1〕。滋腎活絡方為改善高血壓左室肥大的臨床效方，臨床及實驗研究均證實可一定程度上逆轉左室肥厚〔2,3〕，但主要活性成分、靶點仍不清楚，且缺乏整體分析其藥理作用機制的研究。本研究基于網絡藥理學策略，系統研究滋腎活絡方改善高血壓左室肥大的主要活性成分、作用靶標及相關通路，闡釋“藥物-靶點-通路”之間的相互作用，以期系統、全面闡釋其物質基礎和作用機制。

1 材料與方法

1.1滋腎活絡方化學成分與靶點的獲取 利用中藥系統藥理學數據庫和分析平臺(TCMSP，lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)，分別以玄參、牛膝、黃連、牡丹皮、益母草、肉桂為關鍵詞，檢索其含有的化學成分。并依據口服生物利用度(OB)和類藥性(DL)進行篩選，閾值分別設為：OB≥25%，DL≥0.18。并依據參考文獻〔4〕將DL<0.18但具有生物活性的少數分子增補為候選活性成分。

基于Swiss Target Prediction數據庫(http://www.swisstargetprediction.ch)，將可能性(Probability)設置為≥0.7，提取上述候選活性成分的潛在作用靶點；TCMSP檢索候選活性成分作用靶點經Uniprot數據庫(https://www.uniprot.org/)轉換后作為補充。

1.2滋腎活絡方改善高血壓左室肥大作用靶點的獲取 在The Human Phenotype Ontology(HPO)疾病靶標數據庫(https://hpo.jax.org/app/)和DisGeNET數據庫(http://www.disgenet.org)分別以疾病名稱“hypertension”、“myocardial fibrosis”、“left ventricular hypertrophy”等檢索高血壓左室肥大相關基因。

利用Venny2.1(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)在線工具進行滋腎活絡方候選活性成分靶點和高血壓左室肥大相關靶點的映射并繪制韋恩圖，將兩部分的交集靶點為滋腎活絡方改善高血壓左室肥大的作用靶點。

1.3滋腎活絡方單味藥-活性分子-作用靶點網絡構建 將單味藥、活性成分、作用靶點信息導入Cytoscape繪制單味藥-活性成分、活性成分-作用靶點網絡圖，采用Merge功能繪制單味藥-活性成分-作用靶點網絡，基于構建的網絡分析滋腎活絡方改善高血壓左室肥大的作用機制。

1.4蛋白互作網絡構建及分析 利用STRING平臺將滋腎活絡方改善高血壓左室肥大的作用靶點構建靶蛋白互作網絡(PPI network)，組合分數閾值>0.4。應用Cytoscape軟件繪制蛋白互作網絡，Network Analyzer功能對PPI網絡進行拓撲結構分析，計算網絡整體的度值和介數兩個重要拓撲參數，評價滋腎活絡方改善高血壓左室肥大的關鍵靶點。

1.5活性成分分子與關鍵靶點分子對接 基于上述PPI網絡，篩選Degree值最高的5個靶點，以Ledock軟件，與活性成分分子進行對接，以原蛋白質晶體數據中配體與靶點的結合能為參照，評價活性成分與關鍵靶點之間的結合潛力驗證預測的可靠性。

1.6滋腎活絡方改善高血壓左室肥大作用靶點的基因功能和信號通路分析 將滋腎活絡方改善高血壓左室肥大作用靶點導入Metascape數據庫(http://metascape.org)，限定物種為Homo sapiens，Min Overlap為3，Min Enrichment為1.5，P<0.01，進行基因本體論(GO)功能和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析。

2 結 果

2.1滋腎活絡方化學成分與預測靶點 通過TCMSP收集到滋腎活絡方6味中藥的432個化學成分，結合文獻檢索和設定篩選條件進行篩選，得到67個成分，其中9個來自玄參，21個來自牛膝，8個來自益母草，14個來自黃連，11個來自牡丹皮，4個來自肉桂，去重后保留55個候選活性成分。利用Swiss Target Prediction數據庫和TCMSP對候選活性成分進行靶點預測，有42個成分能找到對應潛在靶點241個，共計得到滋腎活絡方949個“成分-靶點”對應信息，展現了滋腎活絡方多成分、多靶點的作用特征。

2.2滋腎活絡方改善高血壓左室肥大的作用靶點 通過HPO數據庫和DisGeNET數據庫，得到高血壓左室肥大相關靶點538個，與241個候選活性成分預測靶點取交集得到47個靶點，為滋腎活絡方改善高血壓心肌肥厚作用靶點，包括腎上腺素受體(ADR)α1A、ADRB1、一氧化氮合酶(NOS)3、基質金屬蛋白酶(MMP)-9、過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARG)γ、血管細胞黏附分子(VCAM)1等。

2.3單味藥-活性成分-作用靶點網絡 將滋腎活絡方6個單味藥、42個成分和47個改善高血壓左室肥大作用靶點信息導入Cytoscape軟件構建單味藥-活性成分、活性成分-作用靶點網絡，采用Merge合并，去除不相關靶點，得到單味藥-活性成分-作用靶點網絡，見圖1。網絡中91個節點，包含6個單味藥、38個成分和47個靶點，304條邊表示藥物、成分和靶點之間相互關系。將這38個成分視為滋腎活絡方改善高血壓左室肥大的活性成分，包括黃酮類(槲皮素、漢黃芩素、黃芩素、山奈酚等)、植物固醇類(β-谷甾醇、豆甾醇等)、脂肪酸(油酸、花生四烯酸、棕櫚油酸等)和生物堿類(小檗堿、甲基黃連堿、小檗紅堿、表小檗堿等)等，見表1。

(◆)表示中藥材；(●)表示化學成分；()表示作用靶點圖1 滋腎活絡方改善高血壓左室肥大單味藥-活性成分-作用靶點網絡

表1 滋腎活絡方改善高血壓左室肥大的活性成分信息

續表1 滋腎活絡方改善高血壓左室肥大的活性成分信息

2.4靶點蛋白互作網絡及關鍵靶點 將預測的滋腎活絡方改善高血壓左室肥大作用靶點導入STRING數據庫進行PPI網絡分析，發現PPI網絡有47個節點蛋白互作，302條相互作用線。其中度值、介數越大顏色越深，說明蛋白相互作用越強。PPI網絡平均度值為13.23，平均介數為1.90×10-2，度值、介數均超過平均值的12個靶蛋白，見表2，處于PPI網絡中的關鍵位置，可能是滋腎活絡方改善高血壓左室肥大作用的關鍵靶點。

表2 滋腎活絡方改善高血壓左室肥大作用關鍵靶點的拓撲參數

2.5滋腎活絡方改善高血壓左室肥大活性成分與關鍵靶點分子對接 為評價活性成分與預測靶點的潛在結合能力，以前述38個活性成分為配體，與PPI網絡中度值最高的5個靶點進行對接。三維結構數值均來自PDB蛋白數據庫(http://www.rcsb.org)，分別為AKT1(PDB代碼：1H10)，TNF(PDB代碼：2AZ5)，IL-6(PDB代碼：1ALU)，NOS3(PDB代碼：1M9J)，IL-1β(PDB代碼：2NVH)，以原蛋白質晶體數據中配體與靶點的結合能為參照，對接結合能數據如圖2所示。結果顯示鼬瓣花素、柳杉酚、黃芩素等34個活性成分與IL-1β的結合能低于原配體；槲皮素、漢黃芩素、山奈酚等26個活性成分與IL-6的結合能低于原配體；異鼠李素、兒茶素、黃藤素等15個活性成分與NOS3的結合能低于原配體；14-去氧-12(R)-磺酸基穿心蓮內酯與TNF的結合能低于原配體，鼬瓣花素與AKT1有一定的結合能力，結合能略高于原配體。上述結果說明滋腎活絡方的活性成分與預測的作用靶點有較好的結合能力，提示預測結果基本可靠。

參考對照虛線為原蛋白質晶體數據中配體與靶點的結合能圖2 滋腎活絡方改善高血壓左室肥大活性成分與AKT1、TNF、IL-6、NOS3及IL-1β分子對接結果

2.6滋腎活絡方改善高血壓左室肥大關鍵靶點的基因功能分析 對滋腎活絡方改善高血壓左室肥大47個靶點進行GO富集分析，歸類分析結果顯示涉及的生物學過程包括血液循環、調節血壓、負性調節細胞增殖、對有毒物質的反應、細胞因子介導的信號通路、第二信使介導的信號、細胞遷移的正調控、脂肪細胞分化、細胞分化負調控、上皮細胞增殖、蛋白質轉運正調控、細胞對脂質的反應、細胞對有機氮化物的反應、細胞對外界刺激的反應等20個功能分類；涉及的分子功能主要包括RNA聚合酶Ⅱ抑制轉錄因子結合、核受體活性、細胞因子受體結合、整合素結合、G蛋白耦聯胺受體活性、氧化還原酶活性、生長因子結合、磷酸酶結合、一氧化氮合酶調節活性、激素結合、支架蛋白結合等15個功能分類；涉及的細胞組分主要包括原纖維膠原三聚體、囊泡腔、肌膜、受體復合物、膜筏等功能分類。

KEGG富集分析結果顯示，47個靶點顯著富集于12大類117條通路上，主要涉及通路見圖3。

MAPK：絲裂原活化蛋白激酶，PPAR：過氧化物酶體增殖物激活受體圖3 滋腎活絡方改善高血壓左室肥大靶點KEGG富集圖

3 討 論

左室肥大是高血壓進程中心臟應對壓力負荷出現的結構及功能變化，主要表現為心肌細胞肥大及心肌成纖維細胞過度增殖活化導致的膠原沉積和間質纖維化〔1〕。滋腎活絡方為改善高血壓心肌肥厚的臨床驗方〔2〕，以玄參、懷牛膝為君，滋補腎陰；黃連為臣，清心降火；佐以丹皮、益母草活血暢通心脈；肉桂溫腎助陽，引火歸原，為佐使藥。諸藥相合，共奏滋腎清心通絡之功，使腎陰得補，心火清降，瘀去水行，脈絡通暢。網絡藥理學分析與中醫藥整體觀思想基本一致，有助于預測該方的藥效物質基礎，系統闡釋其作用機制，為后續的深入研究奠定基礎。

本研究結果提示方中君藥和臣藥起主要治療作用，佐藥和使藥亦發揮作用，表現了組方的合理性。部分成分的藥理作用已得到證實，如槲皮素具有抗高血壓作用〔5〕，亦可降低自發性高血壓大鼠心肌組織膠原含量，改善心肌超微結構和心功能，逆轉其心室肥厚〔6〕；黃芩素能夠顯著減輕血管緊張素Ⅱ誘導的高血壓和心肌重構〔7〕；小檗堿和肉桂醛均可抑制壓力超負荷誘導的小鼠左心室肥大〔8,9〕，肉桂醛還可以抑制轉化生長因子(TGF)-β1誘導的心肌成纖維細胞活化〔10〕。

通過將篩選的活性成分與關鍵靶點進行分子對接，驗證了預測結果的可靠性。且對接結果顯示玄參活性成分14-去氧-12(R)-磺酸基穿心蓮內酯與四個靶點(TNF、IL-6、NOS3和IL-1β)的結合能、牛膝和黃連共有活性成分槲皮素與三個靶點(IL-6、NOS3和IL-1β)的結合能均低于原蛋白質晶體數據庫中相應配體與靶點的結合能。

基于活性成分與已知配體相似度預測成分潛在靶點，整合基于疾病數據庫預測的靶點，獲得滋腎活絡方改善高血壓左室肥大的47個靶點。這些作用靶點通過影響心肌肥大、纖維化和心臟功能等方面參與左室肥大進程。PI3K與其下游主要效應物AKT和心肌細胞大小及存活密切相關〔11〕，有研究發現AKT1基因敲除小鼠心肌質量降低〔12〕。MMP-9參與心肌間質膠原的降解，為預測心肌纖維化標志物之一〔13〕；壓力負荷下心肌細胞產生炎癥介質如IL-6、IL-1β和TNF-α等可促進心臟成纖維細胞活化，啟動纖維化進程〔14〕，在心肌肥厚炎癥反應中起主要作用。NOS3為血管內皮細胞合成NO關鍵酶，抑制NOS可以導致心臟肥大和炎癥狀態〔15〕，加劇壓力超負荷小鼠的左室功能障礙和肥厚〔16〕。VEGF是一種重要的促血管生成細胞因子，可改善心臟功能并防止實驗性心肌梗死小鼠心臟發生左心室重構〔17〕。靶點生物學過程分析結果提示調節心肌肥厚中的炎癥反應是該方主要作用機制之一。

基于KEGG代謝通路的分析結果顯示，滋腎活絡方靶點的代謝通路主要涉及鈣信號、腎上腺素能受體信號、5-羥色胺能突觸、MAPK信號、PPAR信號等信號通路。鈣信號是導致心肌細胞肥大的最基本信號〔18〕，高血壓時壓力負荷造成的機械牽張刺激可通過激活牽張敏感的離子通道導致Ca2+釋放波〔19〕；局部增高的兒茶酚胺結合腎上腺素能β1受體，可磷酸化激活細胞膜和肌漿網Ca2+通道，觸發鈣信號介導的心肌肥大〔19〕。5-羥色胺不僅是高血壓致病因素之一，亦有獨立于血流動力學之外的調節心肌重構作用。研究證實，5-羥色胺可誘發小鼠心內膜下左室纖維化，而HT2AR基因敲除小鼠心肌纖維化減輕〔20〕，心臟中過表達HT2BR會出現心肌細胞數量和大小增加，導致心室肥大〔21〕，抑制HT2BR可減輕主動脈縮窄大鼠的心臟肥大〔22〕。MAPK可調節心肌細胞肥大、炎性反應、成纖維細胞活化和細胞外基質代謝失衡〔23,24〕，在調節心臟肥厚中發揮重要作用。壓力超負荷小鼠心臟組織中3個主要MAPK通路均被激活〔25〕，通過促進心肌細胞生長、減少間隙連接形成、促進心臟纖維化〔26〕等促進病理性心肌肥大的發展。PPAR家族(PPARα、β/δ、γ)是心臟代謝的重要調節劑，在心臟肥大的發病機理中起關鍵作用〔27〕。在壓力超負荷小鼠模型中，PPARα敲除的小鼠表現出較野生型小鼠更明顯的心臟肥大和心臟功能障礙〔28〕；成年小鼠心臟中PPARβ/δ的激活可改善壓力超負荷條件下的心臟功能并抑制心肌纖維化〔29〕；心臟特異性PPARγ基因敲除會誘發小鼠心肌肥大〔30〕。