YAP1、miR-31與老年卵巢癌患者微血管密度的關系

江娜 王秀虹 程欣

(咸寧市中心醫院婦科，湖北 咸寧 437100)

卵巢上皮癌多發生在40歲以上〔1,2〕，癥狀包括腹脹、骨盆疼痛、腹部腫脹和食欲不振等，因此能夠及時評估患者當時病情程度尤為重要〔3〕。研究表明〔4〕，卵巢癌可導致異常細胞有能力侵入或擴散到身體的其他部位且發生重要病理改變，Yes相關蛋白(YAP)1、miR-31及微血管密度(MVD)均參與了這個過程。研究指出，YAP1、miR-31及MVD與卵巢癌有關系，可以作為卵巢癌病理改變的有效觀察指標〔5〕。吳東雅等〔6〕研究指出，YAP1基因不僅可以參與維持器官的大小，還可作為癌基因與人類腫瘤形成密切相關。徐志宏等〔7〕研究提出，miR-31是卵巢癌的獨立危險因素，但在國內與此相關的研究較少。Esencan等〔8〕研究提出，血管生成可通過灌注效應及轉移效應，可促進腫瘤的生長及浸潤、轉移，其中包括卵巢癌在內的實體腫瘤普遍存在的病理現象。本文擬分析YAP1、miR-31與老年卵巢癌患者MVD的關系。

1 對象與方法

1.1研究對象 選取2019年1月至2021年1月在咸寧市中心醫院治療的老年卵巢癌患者105例作為卵巢癌組，選取行健康體檢的63例作為卵巢良性病變組。卵巢癌組年齡60～73歲，平均(63.17±6.18)歲，病程1.0～3.5年，平均(2.13±1.19)，癥狀：腸道壓迫感39例、腹脹32例、骨痛34例，流產史5例，月經紊亂史48例，胃腸脹氣史52例；根據患者檢查結果及依據癌細胞轉移部位、有無發生遠處轉移將其分為早期、中期、晚期3組，分組參考《2017年第4版NCCN卵巢癌臨床實踐指南》〔9〕中對其嚴重程度的評判標準。卵巢良性病變組年齡60～72歲，平均(62.70±5.70)歲，癥狀：腸道壓迫感25例、腹脹27例、骨痛11例，流產史6例，月經紊亂史20例，胃腸脹氣史37例；本研究經醫院倫理委員會批準后，所有研究對象及家屬簽署知情同意書，兩組一般資料差異無統計學意義(P>0.05)。納入標準：卵巢良性病變組存在腹部壓迫痛、小便痛；卵巢癌組符合《2020NCCN卵巢癌包括輸卵管癌及原發性腹膜癌臨床實踐指南(第1版)》〔10〕中對卵巢癌的診斷標準，且患者均存在腹脹、惡心、嘔吐等消化道等癥狀。排除標準：腎臟功能嚴重受損或心力衰竭、陰道流血不止、存在其他腹部疾病、嚴重感染性疾病者、智力障礙、合并惡性腫瘤、凝血功能障礙、病例重復患者、依從性差。

1.2主要設備 試劑及化學物品均為國產分析純。

1.3YAP1、miR-31檢測 取患者卵巢組織后置入10%甲醛溶液固定24 h，常規石蠟包埋，連續切片，在取出樣本中的組織采用免疫組化檢測YAP1、miR-31表達水平，兔抗人YAP1、miR-31、MVD、血管內皮生長因子(VEGF)單克隆抗體、免疫組化檢測，試劑盒分別購自武漢菲恩生物科技有限公司、上海雅吉生物科技有限公司、武漢維克賽思科技有限公司，胞膜及胞質內呈現棕黃色的顆粒表示為陽性細胞，每張切片在高倍鏡下選出5個視野，最后加入蘇木素給予復染，鹽酸乙醇分化后，梯度乙醇進行脫水，用二甲苯沖洗片至透明后進行中性樹脂封片處理，顯微鏡下觀察免疫組化染色情況；根據染色細胞百分比和染色程度進行評估,根據染色程度和染色細胞百分比進行評估：陽性細胞數>5%計為陽性例數，計數標準為0%～5%(-)，6%～20%(+)，21%～50%()，51%～100%()。

1.4YAP1、miR-31、MVD水平檢測 采用實時熒光定量PCR測定YAP1、miR-31、MVD表達量，利用PCR試劑盒合成cDNA。逆轉錄：14 μl模板RNA、2 μl Enzyme mix，4 μl 5×RT緩沖液，補至20 μl，在PCR檢測儀上42℃ 1 h、95℃ 5 min，之后將所合成的cDNA放置于溫度為-20℃環境下進行保存。將血液放在不加抗凝劑的試管中，血液凝固將血清吸出。隨后將血液放在乙二胺四乙酸(EDTA)的試管中后將血漿吸出。采集完成后馬上進行檢測，將抽取血放在取血器后加緩沖液，混勻61 s后將試劑卡滴3滴混合液，插入試劑卡等待185 s，即為YAP1、miR-31、MVD檢測結果。

1.5VEGF水平檢測 抽取患者清晨空腹靜脈血4 ml，離心5 cm、3 000 r/min離心10 min，分離出的上層血清，在-45℃環境下保存，采用酶聯免疫吸附試驗檢測VEGF水平；制作標準品，以1∶2的稀釋液稀釋樣品；在反應孔中加入已稀釋的標準品100 μl/孔，在35℃恒溫孵育箱中濕育2 h；用洗滌液將反應板洗3次后，加入1∶100倍稀釋后的抗體工作液100 μl/孔，放于35℃環境中濕育45 min；在反應孔內加入TMB溶液100 μl/孔，置于35℃環境45 min后在反應孔內加入終止液用來終止反應，在450 nm波長測定吸光度，經繪制標準曲線計算VEGF水平(顏色反應深淺與VEGF呈正比)。

1.6統計學處理 采用SPSS26.0軟件行方差齊性檢驗、t檢驗、Logistic分析及Pearson相關性分析。

2 結 果

2.1兩組YAP1、miR-31表達比較 與卵巢良性病變組相比，卵巢癌組YAP1表達量顯著升高，miR-31表達量顯著降低(P<0.05)，見圖1,表1。

表1 兩組YAP1、miR-31表達比較

2.2兩組MVD、VEGF水平比較 與卵巢良性病變組相比，卵巢癌組MVD、VEGF水平顯著升高(P<0.05)，見表2。

表2 兩組MVD、VEGF水平比較

2.3發生中晚期卵巢癌影響因素的多元Logistic回歸分析 將發生中晚期癌變(早期=0，中晚期=1)作為因變量，將YAP1、miR-31及MVD作為自變量，納入二分類多因素 Logistic回歸模型分析，結果顯示，YAP1、miR-31及MVD為影響中晚卵巢癌發生的因素(P<0.05)，見表3。

表3 發生中晚期卵巢癌影響因素的多元Logistic回歸分析

2.4YAP1、miR-31與MVD相關性 YAP1與miR-31呈負相關(r=-0.028，P=0.008)，與MVD呈正相關(r=0.010，P=0.001)；miR-31與MVD呈負相關(r=-0.017，P=0.003)，見圖2。

圖2 YAP1、miR-31與MVD的相關性

3 討 論

卵巢癌是來源于卵巢與輸卵管的惡性腫瘤,隨著疾病進展,也會轉移到身體其他部位，是目前所認為多種危險因素綜合作用的結果，對于平均風險的女性，不建議進行篩查，因為證據不支持減少死亡，且高誤報率可能導致不必要的手術，伴隨自身的風險〔11〕。臨床上，通過對卵巢癌患者進行病理測定，可判斷其疾病嚴重程度。如何判斷卵巢癌患者疾病嚴重程度，應作為早期診斷卵巢癌的研究策略。

卵巢癌是一種易轉移、侵襲能力強的婦科惡性腫瘤，且復發率及死亡率極高。因此發現卵巢癌發生及發展過程有關鍵作用〔12〕。YAP1可作為癌基因與人類腫瘤形成的重要指標，在研究中通過對小鼠的實驗中發現〔13〕，乳腺癌腫瘤組織中存在具有潛在促癌作用的YAP1基因，可誘導細胞增殖并有效抑制細胞凋亡。在生理狀態下，YAP1可作為Hippo信號轉導通路下游的靶因子，可維持機體內環境的穩態及組織器官的正常大小。有研究表明〔14〕，YAP1在一些腫瘤中表達增強，如胃癌、肝癌、卵巢癌等腫瘤組織中表達水平異常增高，提示此指標活性增強，其與腫瘤發生及發展有一定關系。另有研究表明〔15〕，YAP1過度表達可使肝癌患者肝臟顯著增大，最終導致腫瘤的形成。盡管YAP1在腫瘤形成過程中發揮重要作用，但在卵巢癌的表達水平及臨床特征之間的關系鮮有報道，本研究結果推測YAP1卵巢癌發生及發展中可能發揮作用。本研究發現YAP1在正常水平下可維持機體內環境的穩態及組織器官的正常大小且在卵巢癌發生及發展過程有關鍵作用，但目前有關YAP1在卵巢癌中作用的研究尚少，故需進一步探究。

MiRNA在卵巢癌領域的研究中備受關注，它是最近幾年新發現的腸胃21～26個核苷酸的RNA，在人體內發揮很多生物學作用，且具有預后評價、早期診斷的指導價值，可能成為卵巢癌新的治療靶點，具有極高的生物應用價值〔16,17〕。在已發現的miRNAs中，miR-31是調節惡性腫瘤生物學行為的關鍵基因，有研究報道〔18〕，在結腸癌細胞體系中，miR-31可通過MTI等靶基因增加惡性腫瘤細胞遷移，通過抑制miR-31可快速增強SW480細胞的遷移。另有研究表示〔19〕，在乳腺癌中miRNA是一種抑癌基因，相反在結腸癌中miR-31的表達增強可促進腫瘤的發展，因此認為miR-31在不同腫瘤中截然不同的表達現象在很多實驗中都得到了相應印證，然而，miR-31在卵巢癌中的臨床意義及預后的價值尚未研究。本研究結果發現，miR-31可能是卵巢癌的一個新診斷及預后標志物。

卵巢癌的發生及發展依賴于新生血管的生成，腫瘤細胞通過合成及分泌血管生成因子，可調節腫瘤組織的血管生成〔20〕。VEGF、MVD是腫瘤血管發生過程中的主要正性調控因子，可促進血管生成并參與腫瘤的發展過程，VEGF、MVD可通過作用于特異受體而發揮相應性生物學作用。VEGF、MVD可通過作用于血管內皮細胞上的受體誘導血管的形成，間接促進腫瘤細胞的生長，還可通過作用于腫瘤細胞上的受體，直接促進腫瘤生長。本研究結果與上述結果一致，提示VEGF、MVD可參與卵巢癌的發生及發展，且與卵巢癌細胞增殖密切相關。有研究發現〔21〕，VEGF、MVD通過與其相應受體結合等多種機制參與其中，可促進卵巢癌細胞的生長、血管形成等，MVD可作為預測腫瘤轉移潛能及惡性腫瘤生成的指標。本文結果提示YAP1、miR-31、MVD可能共同參與卵巢癌的發生發展，臨床可根據其高低評估病情嚴重程度。以上結果說明YAP1、MVD的升高及miR-31的降低可加重疾病與腫瘤惡化程度。

綜上，YAP1、miR-31、MVD在卵巢癌中具有一定相關性，其水平的異常表達可加重疾病與腫瘤惡化程度，可用于卵巢癌患者的臨床診斷。