白芨多糖對心肌梗死大鼠PI3K/AKT/GRP78信號通路及心肌細胞內質網應激凋亡的影響

王建營 李晶 于飛 姚光 解立杰 張全意

(濱州醫學院附屬醫院，山東 濱州 256603)

心肌梗死(MI)屬于冠心病的危急重癥之一，是因冠狀動脈硬化、堵塞而導致的冠狀動脈的血流量下降、心肌組織缺血缺氧壞死性疾病，其發病率和死亡率上升，嚴重影響人們的生命健康〔1，2〕。積極尋找有效的治療MI的方法，一直是臨床研究的重點和難點之一〔3〕。冠狀動脈阻塞和粥樣硬化導致的心肌組織缺血可觸發內質網應激(ERS)，適當的ERS可保護心肌細胞免受損傷，而長期嚴重的ERS反而會促進細胞凋亡，加重組織損傷〔4〕，而ERS介導心肌細胞凋亡，在心肌缺血、心室重構等心血管病理發展過程中的調控作用越來越受到臨床研究的重視〔5，6〕。研究發現，磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT) 信號通路可調控ERS，誘導和促進ERS標志蛋白葡萄糖調節蛋白(GRP)78蛋白表達，參與細胞凋亡過程〔7，8〕。但PI3K/AKT/GRP78通路在MI心肌細胞凋亡過程的作用研究較少。白芨多糖是從中藥白芨塊莖中提取分離得到的一種新型葡萄甘露聚糖活性物質，有促進造血、修復潰瘍組織損傷等多種藥理作用，并逐漸受到科研探討和藥物研發的關注〔9〕。但白芨多糖對MI的保護作用，及PI3K/AKT/GRP78通路介導的 ERS心肌細胞凋亡的影響未見報道，本文對此進行探討，以期為白芨多糖在MI領域的開發應用提供實驗參考。

1 材料及方法

1.1材料 健康雄性SD大鼠62只，體重 200～220 g，清潔級由濱州醫學院附屬醫院實驗動物中心提供，批號SYXK(魯)20180022。本研究經醫院動物倫理委員會批準同意，批號為〔2019〕倫審字(KT-002)。白芨多糖(批號：20180624008，購自愛必信上海生物公司，規格：20 mg)；三苯基氯化四氮唑(TTC)試劑盒(貨號：YANJ-298-96-4，購自上海研謹生物公司)；蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(批號：20190721003，購自上海聯邁生物工程公司)；肌酸激酶同工酶(CK-MB)試劑盒(貨號：CSB-E14402，購自上海振譽生物公司)；心肌肌鈣蛋白(cTn)I試劑盒(貨號：JC-E8061，購自上海機純實業公司)；PI3K(貨號：ab39307)、AKT磷酸化(p-AKT,貨號：ab38449)、GRP78抗體(貨號：ab191023)、蛋白激酶R樣內質網激酶(PERK)磷酸化(p-PERK)抗體(貨號：ab192591)、真核細胞翻譯起始因子(eIF)2α磷酸化(p-eIF2α)抗體(貨號：ab32157)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)-12抗體(貨號：ab140882)均購自美國Abcam公司；XSP-2CA光學顯微鏡購自上海坤誠。

1.2方法

1.2.1模型制備及分組處理 參照文獻〔10〕將52只大鼠開胸暴露心臟，結扎左冠狀動脈前降支構建MI模型，以結扎后心前壁變白、心電圖ST段抬高視為結扎成功，術后大鼠成活視為造模成功(50只成功，2只結扎失敗死亡)。隨機分為模型組、白芨多糖低、中、高劑量組、陽性對照組，每組10只；另取10只大鼠，不結扎左冠狀動脈前降支作為假手術組。術后第2天開始給藥，白芨多糖低、中、高劑量組及陽性對照組〔10〕均參照文獻〔11〕設置劑量(白芨多糖100 mg/kg、白芨多糖200 mg/kg、白芨多糖400 mg/kg及卡托普利2.25 mg/kg)并灌胃給藥4 w，1次/d，假手術組與模型組給予等量生理鹽水。

1.2.2血清心肌損傷標志物檢測 麻醉大鼠，取頸動脈血約2 ml，按試劑盒說明書方法測CK-MB、cTnI水平。

1.2.3各組MI面積測定 隨機取6只大鼠，麻醉處死，解剖心臟，生理鹽水漂洗干凈后，沿冠狀面切成5片(厚度大致相同)，TTC染液(2%濃度)避光染色30 min(37℃水浴)后，拍照，以Image pro軟件分析檢測MI面積：MI面積=淡白色區域面積/全心臟切片面積×100%。

1.2.4各組心肌組織細胞損傷及凋亡病理染色 隨機取6只大鼠，麻醉處死，解剖得完整心臟，剪取約0.5 g心尖組織于-80℃保存備用。剩余組織于多聚甲醛中固定24 h后，常規制成厚度為5 μm的石蠟切片，按HE及Tunel染色試劑盒說明書染色處理后，在光鏡下觀察染色情況。Tunel染色的切片，于高倍顯微鏡下觀察并用Image Pro Plus5.0系統計算陽性染色細胞數目，并計算凋亡率=陽性染色細胞數目/(未染色細胞數目+陽性染色細胞數目)×100%。

1.2.5Western印跡檢測 PI3K、p-AKT、GRP78、p-PERK、p-eIF2α蛋白及caspase-12蛋白相對表達水平取冰凍心肌組織，4℃解凍后，機械勻漿、分離得均漿上清液，軸提蛋白后用二喹啉甲酸(BCA)法測蛋白濃度，取50 μg蛋白進行垂直電泳及轉膜反應，5%脫脂奶粉封閉2 h(室溫)及緩沖液清洗后，滴加1∶1 000稀釋的一抗(PI3K、p-AKT、GRP78、p-PERK、p-eIF2α、caspase-12)及1∶2 000稀釋的內參(β-actin)抗體，4℃孵育過夜，滴加1∶1 000稀釋的羊抗兔二抗孵育2 h(室溫)，加入顯影液顯影，顯影系統曝光并拍照，Image-J軟件分析蛋白條帶的相對灰度值，以相對灰度值代表各蛋白的相對表達水平。

1.3統計學方法 采用SPSS22.0軟件進行單因素方差分析、SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1白芨多糖對大鼠MI面積的影響 TTC染色可見模型組心肌組織淡白色染色較多，與假手術組MI面積〔(0.06±0.01)%〕比較，模型組〔(29.03±2.38)%〕白芨多糖低、中、高劑量組〔(22.12±2.24)%、(16.62±2.11)%、(10.51±2.02)%〕及陽性對照組〔(10.08±2.00)%〕均顯著升高(均P<0.05)；與模型組比較，白芨多糖低、中、高劑量組及陽性對照組MI面積均顯著降低，且白芨多糖劑量越高，MI面積降低越顯著(均P<0.05)；白芨多糖高劑量組與陽性對照組MI面積差異無統計學意義(P>0.05)。見圖1。

圖1 各組MI TTC染色

2.2各組心肌組織HE染色病理損傷形態觀察 假手術組心肌結構完整清晰，組織無損傷；模型組心肌組織纖維變性、間質水腫、炎性細胞浸潤等病理損傷嚴重；白芨多糖劑量越高上述病理損傷緩解越明顯，白芨多糖高劑量組對心肌損傷的改善作用與陽性對照組相近。見圖2。

圖2 各組心肌組織(HE染色，×100)

2.3各組心肌組織Tunel染色及細胞凋亡率比較 凋亡細胞被染成棕色，模型組心肌細胞棕色染色加深，與假手術組心肌細胞凋亡率〔(19.23±3.69)%〕比較，模型組、白芨多糖低、中、高劑量組及陽性對照組〔(66.68±5.21)%、(50.12±5.04)%、(41.05±4.81)%、(30.61±4.02)%、(29.08±3.99)%〕均顯著上升，且白芨多糖劑量越高心肌細胞凋亡率降低越明顯(均P<0.05)；白芨多糖高劑量組與陽性對照組心肌細胞凋亡率差異無統計學意義(P>0.05)。見圖3。

圖3 各組心肌組織(Tunel染色，×100)

2.4各組血清中CK-MB、cTnI水平 與假手術組比較，其余各組CK-MB、cTnI水平均顯著升高(P<0.05)。白芨多糖各劑量組及陽性對照組血清CK-MB、cTnI水平均顯著低于模型組(P<0.05)，且白芨多糖劑量越高心肌損傷相關酶水平降低越明顯(均P<0.05)；白芨多糖高劑量組與陽性對照組CK-MB、cTnI水平差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 各組血清CK-MB、cTnI水平比較

2.5各組心肌組織PI3K、AKT、GRP78蛋白達水平比較 與假手術組比較，其余各組心肌組織PI3K、p-AKT蛋白水平均顯著降低，(P<0.05)，GRP78蛋白水平均顯著上升(均P<0.05)。白芨多糖各劑量組及陽性對照組PI3K、p-AKT蛋白水平均顯著高于模型組，而GRP78水平均顯著低于模型組(均P<0.05)；且白芨多糖劑量越高，PI3K、p-AKT上調及GRP78下調趨勢越明顯(均P<0.05)；白芨多糖高劑量組和陽性對照組PI3K、p-AKT、GRP78水平差異均無統計學意義(均P>0.05)。見圖4，表2。

1～6：假手術組、模型組、白芨多糖、低劑量組、白芨多糖中劑量組、白芨多糖高劑量組；圖5同圖4 Western印跡檢測PI3K、p-AKT/AKT、GRP78蛋白的表達

2.6各組心肌組織PERK、p-eIF2α、caspase-12其余各蛋白水平比較 與假手術組比較，其余各組心肌組織p-PERK、p-eIF2α、caspase-12蛋白水平均顯著升高(均P<0.05)；白芨多糖各劑量組及陽性對照組p-PERK、p-eIF2α、caspase-12蛋白水平均顯著低于模型組(均P<0.05)，且白芨多糖劑量越高上述蛋白降低越明顯(均P<0.05)；白芨多糖高劑量組與陽性對照組PERK、p-eIF2α、caspase-12水平差異均無統計學意義(均P>0.05)，見表2，圖5。

圖5 Western印跡檢測p-PERK、p-eIF2α、caspase-12蛋白的表達

3 討 論

MI在細胞水平的病理變化包括心肌細胞凋亡或壞死、細胞外基質大量沉積等〔12〕，MI為心臟突然停止供血疾病之一，中醫治療MI常以活血化瘀為主，并取得較好的療效〔13〕。白芨多糖有促進造血、抗炎抗菌、修復受損組織的作用〔9〕。王剛等〔14〕發現白芨多糖可通過抗氧化、抗炎反應修復人受損傷的角質細胞；李浩宇等〔11〕發現白芨多糖可抑制大鼠肺纖維化過程。而MI是因冠狀動脈血管阻塞，組織缺血而發生氧化應激和炎癥反應〔15〕，本研究結果提示白芨多糖可改善MI大鼠心肌細胞損傷、凋亡及組織壞死，表明白芨多糖對MI有一定的治療作用。

細胞凋亡是導致心肌缺血壞死的重要機制之一，而ERS介導的相關凋亡途徑參與了心肌組織缺血壞死過程〔16〕。GRP78被認為是ERS的標志蛋白，當機體處于ERS狀態時，過表達的GRP78可促進PERK解離、活化，解離、活化PERK又可促進eIF2α發生磷酸化，磷酸化的eIF2α可促使 ATF4 發生轉錄翻譯而導致細胞凋亡〔17〕。蘇學旭等〔18〕發現芪蛭三七湯可抑制MI大鼠心肌細胞凋亡，并推測其抑制MI大鼠心肌細胞凋亡和心室重構作用，可能與抑制GRP78/PERK/eIF2α信號通路激活誘導的ERS凋亡相關。本研究提示GRP78/PERK/eIF2α信號通路激活，MI大鼠心肌細胞嚴重，與文獻〔18〕研究一致，表明MI過程中，心肌組織發生ERS凋亡。研究發現，PI3K/AKT通路不僅參與調控細胞炎癥、氧化應激、凋亡途徑，還參與ERS細胞凋亡過程〔8〕。崔偉等〔19〕發現黃芪甲苷可通過激活PI3K/AKT通路，降低GRP78及caspase-12表達，抑制內皮細胞ERS，保護內皮細胞免受損傷；陽光等〔20〕發現PI3K/AKT信號通路在肝纖維化大鼠肝細胞ERS和凋亡過程發揮重要作用；Liu等〔7〕發現GRP78與PI3K/AKT之間存在雙向調節。本研究結果表明白芨多糖改善MI大鼠心肌細胞凋亡壞死作用，可能是通過激活PI3K/AKT通路，抑制GRP78/PERK/eIF2α信號通路蛋白表達，降低心肌細胞ERS凋亡來實現的。綜上，白芨多糖可激活PI3K/AKT通路，抑制GRP78/PERK/eIF2α信號通路蛋白表達，降低心肌細胞ERS凋亡，改善MI大鼠心肌壞死。為白芨多糖在MI領域的治療提供一定依據。但MI心肌細胞ERS凋亡途徑復雜，涉及多個因子多條通路共同調節，白芨多糖對PI3K/AKT及GRP78/PERK/eIF2α信號通路的調節作用，還應設置通路抑制劑進行深入驗證。