半乳糖凝集素3在心房顫動中主要來源及作用機制

謝建 梁珊珊 宋波 秦忠心 彭俊秋 王冰 趙大奎

(湖北醫藥學院附屬隨州醫院，湖北 隨州 441300)

心房顫動(簡稱房顫)是臨床最常見的心律失常，房顫易導致心力衰竭、心肌梗死等并發癥〔1〕，給家庭和社會帶來嚴重的負擔，因此闡明房顫的發生發展機制對房顫的預防和治療有十分重要的意義。心房纖維化被認為是房顫發生與維持的關鍵因素〔2〕。心房纖維化主要是心肌細胞外基質重構。多種炎癥細胞及炎癥因子參與了心肌細胞外基質重構〔3〕。輔助性T淋巴細胞(Th)17是近年來新發現的一種由Th0細胞在轉化生長因子(TGF)-β1、白細胞介素(IL)-6、IL-23 和IL-21的刺激下分化而成的CD4+T細胞亞群，主要分泌IL-17發揮促炎作用〔4〕，在自身免疫性疾病和機體防御反應中具有重要意義〔5〕，而干擾素(IFN)、IL-4、細胞因子信號傳送阻抑蛋白3則抑制Th0細胞分化為Th17細胞〔6〕。Th17細胞在自身免疫中起重要作用，目前證實Th17輔助細胞主要執行的細胞因子如IL-1、IL-6及IFN等在心力衰竭、病毒性心肌炎、動脈粥樣硬化等多種疾病中發揮重要調節作用〔7，8〕。半乳糖凝集素(Gal)-3是與乙酰-乳糖胺的糖蛋白特異性結合的凝集素家族成員之一，表達于多種細胞，如內皮和上皮細胞、活化巨噬細胞、小膠質細胞、嗜堿性細胞、肥大細胞、中性粒細胞、神經元和心肌細胞等〔9〕。有研究顯示高水平的Gal-3與心臟組織中浸潤巨噬細胞的數量和細胞外基質的沉積呈正相關，Gal-3為心肌纖維化的生物標志物〔10〕。在急性心肌梗死早期，Gal-3促炎、促纖維化作用在心肌組織修復中發揮重要作用〔11〕。然而，持續的高水平Gal-3可誘導炎癥和纖維化的過度激活，導致急性心肌梗死預后很差〔12〕。房顫是最常見的心律失常，免疫細胞浸潤導致心肌組織的炎癥反應與房顫發生相關，炎癥介質可改變心房電生理從而增加房顫的易感性，炎癥還可調節鈣穩態蛋白和連接蛋白，這些均為干擾心房電傳導的房顫觸發因素〔13〕。然而，目前關于Gal-3在房顫中的作用及其主要來源尚未明確。本研究擬探究Gal-3在房顫動物模型中的表達及分泌來源和作用機制，從而為房顫治療提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1實驗材料 實驗SD大鼠購自上海斯萊克生物有限公司、TGF-β1抗體(貨號3711)、平滑肌肌動蛋白(α-SMA)抗體(貨號14968)、基質金屬蛋白酶(MMP)-9抗體(貨號3852)均購自CST公司；PE-抗大鼠CD3 單抗(貨號A14811)APC-標記抗大鼠 CD4 單抗(貨號A23523)、Gal-3單克隆抗體(貨號p10212)均購自R&D公司；大鼠Gal-3酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(貨號YHS3135)購自上海煊翎生物有限公司；Masson染色試劑盒購自上海碧云天生物有限公司；引物均由上海杰李生物有限公司合成。一步法反轉試劑盒(貨號p434821)和熒光染料(貨號P004392)購自Thermo。

1.2構建SD大鼠房顫模型 按隨機數字表法將60只雄性SD大鼠(體重250～300 g)分為對照組(20只)、房顫組(20只)和房顫干預組(20只)。實驗時3組大鼠均用1%戊巴比妥鈉腹腔麻醉并氣管插管，連接心電監護。房顫組用食道電極經口送入食管比鄰心房處，電極連接電生理儀，設置電生理儀參數(電壓20 V，電流4 mA，脈寬6 ms)，通過電生理儀發放脈沖波快速起搏心房。每次刺激30 s，間隔5 min待恢復竇性心律再次刺激，5次/d，通過心電監護確認房顫發作以證明模型構建成功。記錄心臟心電圖的詳細情況，房顫的發生時間以P波消失并出現典型房顫波為標志，以恢復竇性心律作為房顫的終止，期間即為SD大鼠造模后房顫的持續時間。房顫干預組除上述處理外每48 h經腹腔注射Gal-3單克隆抗體100 μg，詳細記錄心電圖。對照組僅在麻醉后氣管插管和心電監護，不進行食道心房刺激。

1.3SD大鼠標本采集 ①血液標本收集：在實驗開始前、實驗第5天和第10天經鼠尾靜脈取血50 μl，立即注入乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管并充分搖勻，2 000 r/min離心20 min后分離血漿，并將血漿分裝于-80℃低溫冰箱保存。②組織標本收集：于實驗第10天將大鼠用1%戊巴比妥鈉腹腔深度麻醉后將大鼠前胸壁打開，快速取出心臟，置于生理鹽水中去除血液，取50 mg左右心房組織于4%多聚甲醛容器內保存，剩余心房組織置于-80℃冰箱保存。

1.4檢測血漿Gal-3水平 用大鼠Gal-3 ELISA試劑盒檢測大鼠血漿Gal-3蛋白水平。所有血漿樣品檢測重復進行，以確保變異系數(CV)低于10%，具體操作步驟根據ELISA試劑盒說明書進行。

1.5RT-PCR檢測組織標本中Gal-3的表達 Trizol提取總 RNA，瓊脂糖電泳檢測其完整性，分光光度計測其純度和濃度。按照試劑盒的說明進行RT-PCR，檢測心肌組織中Gal-3 的表達情況。以 β-actin 為內參照，分析基因的相對表達量。Gal-3：正向引物序列 5′-TCGTAACGTACCAGACG-3′，反向引物序列 5′-CCGTGTACAGTCATGG-3′；β-actin：正向引物序列5′-ACTGATCGCCACCGCAG-3′，反向引物序列5′-ACCACAGTGTGCCGATCTGG-3′。

1.6流式細胞術分選心房組織中浸潤的淋巴細胞 取病變區的心肌組織，眼科剪刀剪碎，用胰酶和膠原酶反復消化，待組織徹底裂解為單個細胞后，用400目的尼龍網去掉上清液中的團塊，再用紅細胞裂解液去除紅細胞，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后制成單細胞懸液。所得細胞以 PMA 50 ng/ml，離子霉素1 μg/ml刺激，同時加入蛋白轉運抑制劑莫能霉素1 μg/ml，置于37℃、5 %CO2培養4 h。收集細胞后依次進行表面抗原染色(PE-抗大鼠CD3單抗和APC-標記抗大鼠CD4單抗，流式細胞儀上應用活細胞分選術分選CD4+細胞和CD3+的其他成熟T淋巴細胞，運用流式軟件FlowJo VX10統計輔助T淋巴細胞占所有成熟T淋巴細胞的比例。將流式分選后的CD3+/CD4+細胞和CD3+/CD4-的其他成熟T淋巴細胞收集并培養，校準細胞數量后，培養24 h后ELISA試劑盒檢測上清中Gal-3蛋白的水平。

1.7心房顫動參數 SD大鼠離體心臟的心尖和右心房處分別連接電極，利用Langendorff 離體心臟灌流系統灌注離體SD大鼠心臟，同時生物電測量。生物電刺激由固定在心房壁上面的電極發放，每8個S1刺激后給予一個S2刺激，并且不斷縮短S1、S2刺激間期的間隔，最終S2刺激會落在1個S1刺激的心房肌有效不應期內，從而S2刺激不能產生心跳，這個時間間隔即心房肌有效不應期。檢測3組心房肌有效不應期，同時統計3組動作電位時程。

1.8Masson染色 心臟組織切片經二甲苯及不同濃度酒精水化至蒸餾水，Masson染色液中染1 h，蘇木素染20 min，自來水洗，0.5%鹽酸酒精分化30 s，麗春紅-品紅液染色10 min，充分水洗，脫水、透明、封片，運用Image軟件分析心肌纖維化水平。

1.9Western印跡 用RIPA裂解心臟組織，組織破碎儀震蕩，12 000 r/min離心20 min，去上清進行蛋白濃度測定，再用6×上樣緩沖液制樣。上樣90 V恒壓電泳，然后以400 mA恒流將蛋白轉到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，用含5%脫脂奶粉的TBST溶液封閉PVDF膜1 h。封閉結束后，在含5%牛血清白蛋白(BSA)的TBST中的抗體4℃過夜，二抗室溫結合2 h，加入顯影液曝光顯影，每組復孔3次。封閉結束后，根據目標蛋白條帶所在位置剪切條帶，將對應條帶分別在含有0.1%的TGF-β1抗體、α-SMA抗體、MMP-9抗體、tubulin抗體的TBST溶液中4℃敷育過夜，然后在TBST溶液中洗膜，在對應二抗溶液中室溫敷育2 h，TBST洗膜后加入顯影液曝光顯影。

1.10統計學方法 采用GraphPad Prism6.0軟件進行方差分析及t檢驗。

2 結 果

2.1兩組Gal-3水平比較 房顫組血漿中Gal-3水平〔(4.23±0.31)ng/L〕顯著高于對照組〔(1.27±0.19)ng/L,P<0.05〕；房顫組心房組織中Gal-3 mRNA水平(5.46±0.78)顯著高于對照組(1.04±0.08，P<0.05)。

2.2兩組CD3+/CD4+占成熟T淋巴細胞的比例比較 房顫組CD3+/CD4+占成熟T淋巴細胞的比例〔(50.12±4.56)%〕顯著高于對照組〔(13.27±1.73)%,P=0.007〕。見圖1。

2.3兩組T淋巴細胞亞群中Gal-3水平比較 對照組CD3+/CD4-的成熟T淋巴細胞上清中Gal-3水平〔(0.11±0.03)ng/L〕顯著低于房顫組〔(0.19±0.06)ng/L,P<0.05〕;對照組CD3+/CD4+的成熟T淋巴細胞上清中Gal-3水平〔(0.21±0.03)ng/L〕顯著低于房顫組〔(0.39±0.04)ng/L，P<0.05〕；且兩組CD3+/CD4+的成熟T淋巴細胞上清中Gal-3水平顯著高于CD3+/CD4-的成熟T淋巴細胞上清中Gal-3水平(均P<0.05)。表明房顫時血清中高水平的Gal-3主要來源于CD3+/CD4+細胞。

2.43組心電圖基本參數比較 對照組無房顫發生；在刺激期房顫組均發生房顫，表明房顫模型構建成功；房顫干預組僅16只發生房顫，房顫發生率80%。房顫組平均心率、房性期前收縮個數、房性二聯律個數、房性三聯律個數、房顫持續時間均顯著高于對照組，而給予Gal-3抗體干預后上述指標均顯著降低(均P<0.05)。見表1。

2.53組心房不應期和動作電位時程水平比較 房顫組心房不應期及動作電位時程均顯著低于對照組，而給予Gal-3抗體干預后上述指標均顯著升高(均P<0.05)。見表2。

表2 3組心房不應期和動作電位時程比較

2.63組心房組織間質纖維化 房顫組心房組織間質纖維化水平〔(4.08±0.59)%〕顯著高于對照組〔(1.02±0.05)%〕，而給予Gal-3抗體干預后心房組織間質纖維化水平顯著降低〔(2.12±0.17)%,P<0.05〕。見圖2。

圖2 3組心房組織間質纖維化(Masson,×200)

2.73組心房組織纖維化相關蛋白水平比較 房顫組TGF-β1、α-SMA、MMP-9水平均顯著高于對照組，而給予Gal-3抗體干預后上述指標均顯著降低(P<0.05)。見圖3，表3。

圖3 3組組織纖維化相關蛋白水平

表3 3組心房組織纖維化相關蛋白水平比較

3 討 論

Gal-3可通過促進中性粒細胞和單核細胞活化，誘導肥大細胞炎癥介質釋放及促進中性粒細胞和層黏連蛋白及內皮細胞的黏附促進炎癥反應，Gal-3可促進T細胞的激活和刺激上皮細胞、內皮細胞、成纖維細胞產生多種細胞因子如IL-6、IL-8、粒細胞-巨噬細胞刺激因子和化學增活素及細胞黏附分子(CAM)-1，從而導致炎癥的產生〔14〕。Gal-3是T細胞誘導炎癥反應的早期啟動因子，可通過促進釋放前炎性細胞因子來放大炎癥反應，并參與了心房纖維化〔15〕。

研究發現相對于健康志愿者，心力衰竭患者Gal-3、IFN-γ、IL-17A和TGF-β水平升高，并與臨床嚴重程度相關，Gal-3是一種高特異性的診斷心力衰竭和判斷臨床嚴重程度的生物標志物〔16，17〕。研究表明高水平的Gal-3與心力衰竭患者的死亡率有顯著的相關性〔18〕，房顫是心房電重構的結果，而心肌纖維化是導致心房電重構、心臟電活動的發生和傳導異常，促進房顫發生的重要原因〔19，20〕。本研究結果提示抗炎治療可能是房顫的治療途徑之一。

初始CD4+T 細胞接受抗原刺激后，在不同的條件下可分化成不同亞型的T細胞，執行不同的功能。其分化方向受抗原的性質、局部環境中的激素及細胞因子等多種因素調控〔21〕，其中細胞因子的種類和細胞因子之間的平衡對T淋巴細胞的分化有重要的調節作用〔22〕。許多轉錄因子如Foxp3可特異性調控Th17細胞的活化〔23，24〕，因此通過調控轉錄因子的表達及加入炎癥因子中和抗體抑制T 細胞的增殖活化，是改善房顫的重要途徑。

研究發現CD4+CD25+調節T細胞能抑制T淋巴細胞產生IL-2和IFN-γ，明顯促進TGF-β的產生〔25〕，當加入抗TGF-β 中和性抗體時，可抑制心房組織纖維化的發生〔26〕。本研究結果表明，加入抗Gal-3中和性抗體可顯著改善心房組織纖維化。

綜上，大鼠房顫模型中心房組織的Gal-3基因水平和蛋白質水平均顯著升高，且Th17是房顫時高水平Gal-3的主要來源，Gal-3與房顫時炎癥和纖維化的發生相關。Gal-3是一種有強大的招募中性粒細胞的前炎性細胞因子，能促進多種細胞釋放炎性因子，在心房組織重塑及心房間質纖維化過程中發揮重要作用，是調節房顫發生的重要靶點。