基于Wnt/β-catenin信號通路探討阿魏酸對大強度力竭運動大鼠軟骨細胞損傷的保護作用

王洲 付燕 王莉

(1西南民族大學，四川 成都 610041；2四川省人民醫院)

骨關節炎(OA)是軟骨細胞和基質退行性改變的一種骨關節疾病，主要以關節疼痛、積液滲出、活動受限為主要的臨床特點〔1～3〕。研究發現長期大強度訓練會增加OA風險，運動員在大強度訓練時引起的骨關節炎，不僅影響競技狀態及比賽成績，甚至會出現關節畸形或致殘〔4〕。軟骨細胞是關節內合成分泌的重要細胞，能夠調控關節內環境的穩定性，當關節內環境紊亂時，軟骨細胞識別異常作出應答，調整細胞外基質的合成，保持關節內環境的穩定〔5〕。Wnt/β-catenin是機體內重要的信號通路，廣泛參與多種細胞的生命活動，如組織分化、損傷再生、細胞內環境維持、抗應激損傷等〔6〕。研究表明Wnt/β-catenin通路的激活影響軟骨細胞的增殖、分化、移行，在維持骨關節的正常結構、修復損傷過程中Wnt/β-catenin通路起重要的作用〔7〕。阿魏酸(FA)是從植物細胞壁提取的低毒、多酚類化合物，具有抗氧化、抗血栓、抗炎癥、抗血脂等作用，具有強大的抗炎、修復、治療作用，廣泛應用于醫藥領域和食品領域〔8〕。本研究從Wnt/β-catenin信號通路入手探討FA對OA軟骨細胞的保護作用。

1 材料和方法

1.1試驗材料及主要試劑 FA、Ⅱ型膠原酶購自Sigma公司；胰蛋白酶、DMEM培養基、Ⅱ型膠原抗體購自武漢博士生物工程有限公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒化學發光試劑盒購自廣東銳博生物科技技術股份有限公司；兔抗基質金屬蛋白酶(MMP)13、兔抗大鼠wnt2、兔抗大鼠磷酸化GSK-3p(p-GSK-3p)、Ser9抗體、兔抗β-catenin、兔抗GAPDH及山羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G購自美國Abcam公司。

1.2實驗動物及分組 清潔級雄性SD大鼠，大鼠體重(210±20)g，購自軍事醫學科學院實驗動物中心，動物合格證號：SCXK(京)2003-1-003。大鼠進食標準飼料，自由飲水。室溫20～23℃，相對濕度45%～50%，光照時間為12 h/d。參照隨機數字表分為空白組、模型組、低劑量組、高劑量組。

空白組給予1 ml生理鹽水腹腔注射后安靜休息；模型組腹腔注射1 ml生理鹽水，1 h后將大鼠放在(32±1)℃水溫的桶內，進行一次尾部負重3%體重重物的游泳力竭運動；低劑量組腹腔注射FA溶液(5 μmol/ml)，1 h后進行1次力竭運動，運動方式同模型組；高劑量組腹腔注射FA溶液(20 μmol/ml)，1 h后進行1次力竭運動，運動方式同模型組。參考Thomas等〔9〕力竭標準：大鼠連續沉入水中超過10 s不能浮出或大鼠無法協調運動且伴隨無方向性亂竄，以存活大鼠為實驗對象。本研究中動物處置方法均符合動物倫理學標準。

1.3軟骨細胞分離培養及鑒定 從各組大鼠膝蓋中取軟骨細胞，0.25%胰蛋白酶消化，37℃消化30 min，棄去胰蛋白酶，加入DMEM培養基過夜，1 200 r/min離心10 min，棄上清，加入DMEM培養基混勻，置于37℃恒溫箱中，37℃，5%CO2培養傳代。鑒定：細胞制成爬片，二甲苯和梯度乙醇脫蠟后置于檸檬酸鹽緩沖液中進行修復，以充分暴露抗原決定簇。3%的過氧化氫室溫下浸泡10 min，封閉，分別加稀釋好的一抗4℃過夜孵育，次日沖洗干凈，加入適量生物素標記的二抗室溫孵育30 min，清洗。加適量二氨基聯苯胺四鹽酸鹽(DAB)作用2～5 min后用去離子水終止反應，蘇木素復染1.5～2 min，清洗后于梯度乙醇中脫水，二甲苯浸泡并干燥后用中性樹膠封片，鏡檢觀察并記錄實驗結果。

1.4透射電鏡觀察大鼠膝關節軟骨超微結構的形態學變化 取膝關節股骨內側髁關節軟骨組織(大小1 mm×1 mm×1 mm)，使用2.5%戊二醛，于4℃下固定6 h后，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗30 min，1%鋨酸固定1 h。參考文獻方法〔10〕進行乙醇梯度脫水、純環氧樹脂包埋及烘干固化。采用LKB-NOVA型切片機進行超薄切片(片厚70 nm)，蒸餾水沖洗后，分別放入醋酸鈾飽和水溶液和枸櫞酸鉛染液中染色30 min，蒸餾水反復清洗后，干燥，最后用日產JEM-1230型透射電鏡觀察攝片。

1.5CCK-8法檢測軟骨細胞的增殖率 取對數期的軟骨細胞，調整細胞濃度為1×105個/ml，取100 μl加入96孔板中，加入DMEM培養基放置于37℃，5%CO2培養24 h，將FA分別稀釋到80、40、20、10、5 μg/ml、每孔加入10 mg/ml的CCK-8溶液，5%CO2培養4 h，棄去CCK-8溶液，加入200 μl DMSO溶液，震蕩10 min，使其完全溶解，全自動酶標儀波長490 nm處測量各孔的吸光值。

1.6酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測IGF-1和PGE2濃度 取各組軟骨細胞培養上清，按照ELISA試劑盒操作說明進行檢測。

1.7蛋白免疫印跡檢測MMP13、Wnt2、p-GSK-3p、β-catenin、B淋巴細胞瘤(Bcl)-2、Bcl-2相關X蛋白(Bax)的表達 加入細胞裂解液，冰上放置20～30 min，超聲裂解30 s，12 000 r/min，4℃離心10 min，收集上清，置于-20℃保存。BCA定量法檢測蛋白濃度，待測樣品和上樣緩沖液混合，100℃水域變性5 min，然后加入制備好的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)(5%濃縮膠，10%分離膠)上樣孔中，每孔25 μl，濃縮膠時調整電壓為60 V，分離膠電壓為120 V，結束后取出凝膠，4℃轉膜1.5 h，采用5%脫脂奶粉封閉聚偏氟乙烯(PVDF)膜2 h，加入一抗，4℃過夜，TBST洗膜后加入辣根過氧化物標記的羊抗兔IgG，37℃孕育2 h。加入電化學發光試劑(ECL)顯影，采用自動凝膠成像系統采集圖像，以GAPDH作為內參，分析蛋白水平。

1.8統計學分析 采用SPSS16.0軟件進行t檢驗，制圖采用Graphpad5.01軟件。

2 結 果

2.1各組軟骨細胞對比及鑒定 空白組軟骨細胞基質呈淺棕色、排列整齊，著色均勻，而細胞核無著色；模型組軟骨細胞基質著色深，出現嚴重變形或排列紊亂，孔隙不均勻增大，細胞核均著色；與模型組相比，低劑量組及高劑量組軟骨細胞基質著色較淺，部分細胞核著色，尤其是高劑量組改善明顯。見圖1。

圖1 空白組軟骨細胞和模型組OA軟骨細胞形態學觀察(DAB，×200)

2.2FA對力竭運動大鼠OA軟骨細胞超微結構的影響 空白組軟骨細胞呈卵圓形，細胞膜及細胞核完整，細胞質內可見完整線粒體、粗面內質網及高爾基體；模型組細胞大部分呈現腫脹狀態，細胞核形態異常，胞質內脂滴增多，線粒體數目明顯減少，大部分粗面內質網高度擴張，部分溶解斷裂；低劑量組軟骨細胞部分呈現腫脹形態，細胞質空泡化，可見脂滴，線粒體數目減少，且明顯變形，粗面內質網擴張明顯；高劑量組軟骨細胞少部分腫脹，細胞核基本正常，線粒體空泡化，線粒體嵴較模糊，可見輕度擴張的粗面內質網。見圖2。

圖2 FA對力竭運動大鼠OA軟骨細胞超微結構的影響(×20 000)

2.3FA對力竭運動大鼠OA軟骨細胞增殖的影響 模型組軟骨細胞增殖率(19.6%)顯著低于空白組(98.5%)，低劑量組(52.6%)、高劑量組軟骨細胞增殖率(75.1%)顯著高于模型組，且高劑量組軟骨細胞的增殖水平更高(均P<0.05)。

2.3FA對力竭運動大鼠OA軟骨細胞IGF-1和PGE2水平的影響 模型組IGF-1水平明顯低于空白組，而低劑量組和高劑量組IGF-1水平明顯高于模型組(P<0.05)。模型組PGE2水平明顯高于空白組，而低劑量組和高劑量組PGE2水平明顯低于模型組(P<0.05)，見表1。

表1 FA對力竭運動誘導的OA軟骨細胞IGF-1和PGE2水平的影響

2.4FA對力竭運動大鼠OA軟骨細胞MMP13表達的影響 模型組MMP13蛋白表達(3.85±0.41)明顯高于空白組(1.04±0.08，P<0.05)，而低劑量組(2.82±0.33)和高劑量組IGF-1水平(2.05±0.18)明顯低于模型組(P<0.05)，見圖3。

圖3 Western印跡檢測MMP13蛋白表達

2.5FA對力竭運動大鼠OA軟骨細胞凋亡蛋白Bcl-2、Bax的影響 與空白組相比，模型組Bcl-2明顯降低，Bax顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，低劑量組、高劑量組Bcl-2明顯升高，Bax明顯降低(P<0.05)，且高劑量組的變化更明顯(P<0.05)，見圖4，表2。

圖4 FA對LPS誘導的OA軟骨細胞凋亡蛋白Bcl-2、Bax的影響

表2 細胞凋亡蛋白Bcl-2和Bax相對表達量

2.6FA對力竭運動大鼠OA軟骨細胞Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白表達的影響 與空白組相比，模型組Wnt2、p-GSK-3β、β-catenin水平明顯升高，與模型組比較，低劑量組、高劑量組wnt2、p-GSK-3β、β-catenin水平明顯降低(P<0.05)，FA呈劑量依賴性，見圖5，表3。

圖5 FA LPS誘導的OA軟骨細胞Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白表達的影響

表3 Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白表達量

3 討 論

OA是一種常見的關節軟骨病變，以繼發性骨質增生為主要病理表現，致病原因多為過度勞損、衰老損傷、先天關節畸形等原因導致關節軟骨破壞、關節間隙狹窄、滑膜增生等〔11〕。文獻報道〔12〕稱OA最先出現骨細胞增殖障礙，細胞活性降低，隨著病情的發展會出現關節細胞壞死，最終引起骨關節代謝性增生。FA具有降血脂、抗血栓、抗氧化等生物活性，能夠減少機體合成IL-1β，提高機體超氧化歧化酶的活性，減少丙二醛的含量緩解OA患者的臨床癥狀，對OA引發并發癥具有良好的改善作用〔13〕。本研究結果說明FA具有保護OA軟骨細胞的功能。IGF-1作為軟骨細胞合成因子，在促進細胞生存代謝過程中起著重要作用，其分泌減少和OA發生密切相關。PGE2是骨關節炎促炎癥因子和分解代謝介質，文獻報道〔14，15〕稱其能夠促進MMPs的合成，MMP13是由軟骨細胞合成分泌的一種膠原酶，主要溶解Ⅱ型膠原蛋白，發生OA時，細胞碎片上調MMP13的表達，阻礙Ⅱ型膠原蛋白的表達，加速骨蛋白的多糖的流失，使軟骨細胞遭受損害。本研究結果說明FA能夠抑制MMP13表達和PGE2水平來保護骨關節軟骨基質。細胞Bax作為促凋亡基因，主要通過與線粒體結合，促進其釋放促凋亡蛋白誘導凋亡，而Bcl-2則會阻止Bax與線粒體結合，從而抑制細胞凋亡〔16〕，本研究結果提示FA能夠抑制軟骨細胞的凋亡。

文獻報道〔17〕稱Wnt/β-catenin信號通路與骨細胞的移行、黏附、分化、骨關節正常生長、損傷修復過程有關，該信號通路激活會加重OA的發展，經典的β-catenin信號通路活化表現為β-catenin在細胞質中積累并移向細胞核，與T細胞核因子和淋巴增強因子共同作用，啟動Wnt下游轉錄。研究表明〔18〕GSK-3β能夠促進β-catenin的降解，在多種腫瘤模型中已經證實抑制GSK-3β能夠促進β-catenin信號通路激活。研究人員〔19〕將新型沒食子酸作用于軟骨細胞，發現該沒食子酸能激活Wnt/β-catenin通路，促進軟骨細胞增殖。本研究結果顯示大強度力竭運動構建OA模型后，Wnt2、β-catenin水平明顯升高，且促進了GSK-3β的磷酸化，從而提示Wnt/β-catenin信號通路參與了OA的發生發展，采用FA處理后，Wnt2、β-catenin及p-GSK-3p水平明顯降低，說明FA可能是通過抑制Wnt/β-catenin信號通路，起到保護軟骨細胞的作用。