上調乳腺癌細胞MCF-7中IGFBP-6基因對細胞增殖的影響

薛晶 程玉 陳永良 嚴曉麗 嚴鵬 申興斌

(承德醫學院 1形態實驗中心，河北 承德 067000；2附屬醫院)

乳腺癌是世界范圍內女性最常見的惡性腫瘤之一，也是導致女性死亡的重要因素，近年來其發病率及死亡率有逐年上升的趨勢〔1～4〕。對于乳腺癌的治療，早期手術切除效果較好，但是如已發生轉移，手術效果會大打折扣，因此尋找治療乳腺癌的有效靶點已迫在眉睫。胰島素樣生長因子(IGF)家族調控細胞增殖、分化、凋亡及癌變，這些不同的生物活性主要通過IGF與受體Ⅰ型和Ⅱ型(IGF-ⅠR和IGF-ⅡR)的結合介導。流行病學研究表明，胰島素樣生長因子結合蛋白家族(IGFBPs)與幾種常見癌癥的風險增加有關〔5〕。IGFBP-6通過特異性結合IGF-Ⅱ抑制細胞增殖〔3〕?；蛐酒芯恳脖砻鱅GFBP-6在癌癥中具有抗增殖作用〔7〕。IGFBP-6對乳腺癌的作用尚無報道，因此本文主要探討IGFBP-6對乳腺癌組織及細胞的影響。

1 材料與方法

1.1材料 收集2017年4月至2018年2月承德醫學院附屬醫院病理科乳腺癌手術切除石蠟標本80例及癌旁組織標本50例，術前告知患者并與家屬簽署知情同意書。患者術前均未接受過任何形式的放化療治療。

細胞系及主要試劑：人乳腺癌細胞MCF-7購自北京北納創聯生物技術研究院，DMEM培養基、胰酶購自美國Gibco公司，優級胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司，IGFBP-6質粒購自蘇州吉瑪基因股份有限公司，IGFBP-6抗體購自英國Abcam公司(1∶100稀釋)、二氨基聯苯胺(DAB)顯色劑購自福建邁新生物技術開發有限公司，實驗所需無水乙醇、二甲苯均為分析純，均由承德醫學院病理學與病理生理學重點學科實驗室提供，Trizol試劑購自Invitrogen公司，IGFBP-6基因和β-actin 均由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

主要儀器：二氧化碳培養箱(美國Thermo公司)，超凈工作臺(上海新苗醫療器械制造有限公司)，倒置相差顯微鏡(德國Leica公司)，全自動酶標儀ELX808(美國伯騰儀器有限公司)。

1.2免疫組織化學法檢測乳腺組織中IGFBP-6的表達 采用免疫組化Maxvision法檢測乳腺癌及癌旁乳腺組織中IGFBP-6的表達，根據步驟依次進行，加一抗(稀釋1∶100)，二抗，DAB顯色。結果根據Volm雙評分法判定。

1.3細胞培養及轉染 乳腺癌細胞MCF-7用含10%胎牛血清的DMEM完全培養基，放置于37℃，5%CO2恒溫培養箱，細胞每2～3 d傳代一次，取對數生長期細胞用于后續實驗。取對數生長期的細胞，胰酶消化，調整細胞密度為1×105個/ml，接種到6孔板中，每孔加2 ml細胞懸液，細胞分為實驗組和空白對照組，實驗組轉染IGFBP-6。操作步驟按照Transemate試劑盒說明書進行。

1.4MTT法檢測上調IGFBP-6對乳腺癌細胞增殖的影響 將實驗組和空白對照組細胞接種與96孔板，每孔接種細胞1×104個，每組設6個復孔，37℃培養24 h后實驗組轉染，培養24、48、72 h后，每孔加10 μl MTT溶液(5 mg/ml)，繼續培養4 h，終止培養，棄掉培養基，每孔加入15 μl二甲基亞砜(DMSO)，酶標儀上震動10 min，測定波長在490 nm處各孔細胞的光密度(OD)值。

1.5qRT-PCR法檢測IGFBP-6 mRNA的表達 轉染后36 h收集細胞，按照Trizol說明書提取總RNA，評價RNA純度，根據天跟FastQuant 試劑盒說明書合成cDNA第一鏈。PCR所用引物由上海生工設計，引物序列：H-GAPDH正義鏈為5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，H-GAPDH反義鏈為5′-TGGTGAAGACGACAGTGGA-3′；IGFBP-6正義鏈為5′-AGGAATCCAGGCACCTCTACCAV-3′，IGFBP-6反義鏈為5′-AGCACTGAGTCCAGATGTCTACGG-3′，將PCR體系加入8聯排，反應條件參照說明書在CFX96定量PCR儀中運行，實驗重復3次。轉染48 h后取所有組別的細胞，提取RNA，采用熒光定量PCR檢測轉染后RNA相對表達量，ΔΔCt為mRNA的相對表達量，ΔΔCt=實驗組〔Ct(IGFBP-6)-Ct(GAPDH)〕-空白對照組〔Ct(IGFBP-6)-Ct(GAPDH)〕。

1.6Rt-PCR法檢測乳腺癌組織中IGFBP-6 mRNA的表達 采用TRIzol一步法對組織提取RNA，所用組織為乳腺癌及癌旁乳腺組織，所用引物為IGFBP-6和GAPDH。取擴增產物行2%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色跑膠20 min后在紫外熒光數字成像儀下攝像，進行定量分析，以IGFBP-6與相應GAPDH擴增產物條帶累積吸光度的比值作為IGFBP-6 mRNA的相對表達量。

1.7統計學方法 采用SPSS19.0軟件進行秩和檢驗、兩獨立樣本t檢驗和方差分析。

2 結 果

2.1乳腺癌及癌旁組織中IGFBP-6的表達 IGFBP-6主要表達于癌旁乳腺組織及乳腺癌細胞質中，呈棕黃色顆粒狀，著色不一。在乳腺癌標本80例中，IGFBP-6表達陰性18例(22.50%)，弱陽性55例(68.75%)，中度陽性6例(7.50%)，強陽性1例(1.25%)；癌旁組織50例中，IGFBP-6表達陰性1例(2.0%)，弱陽性7例(14.0%)，中度陽性13例(26.0%)，強陽性29例(58.0%)?？梢钥闯鋈橄侔┲蠭GFBP-6表達陽性率及染色強度較癌旁組織顯著降低(P<0.05)，推斷IGFBP-6在乳腺癌中低表達。見圖1。

圖1 IGFBP-6癌旁組織及乳腺癌組織中的表達(Maxvision法，×40)

2.2上調IGFBP-6抑制乳腺癌細胞MCF-7的增殖能力 轉染24 h、48 h后，MTT法檢測顯示實驗組的細胞增殖活性均顯著低于空白對照組(P<0.05)。見表1。

2.3轉染后MCF-7細胞IGFBP-6的表達 實驗組IGFBP-6表達明顯高于空白對照組(P<0.05)。見表1。

2.4乳腺癌組織及癌旁組織IGFBP-6 mRNA表達比較 乳腺癌組織IGFBP-6 mRNA表達明顯低于癌旁正常組織(0.44±0.04 vs 0.83±0.08,P<0.05)。

3 討 論

乳腺癌治療以手術為主要方法，并結合放化療,內分泌治療等綜合治療方法，但乳腺癌生物行為有待研究，治療效果欠佳，預后難料〔8〕。這可能與乳腺癌的生物學異質性有關。近年來腫瘤的生物學治療得到越來越多的關注，乳腺癌靶向治療成為臨床研究熱點，其治療效果也得到顯著提高〔9〕。因此，需要新的預后標志物和治療靶點來指導和改進乳腺癌患者的治療方法。

對IGF軸進行異常刺激可以導致癌癥的發展和進展〔10〕。研究表明與非腫瘤組織相比，胃腺癌組織中IGFBP-6的表達降低，且分化程度越低，IGFBP-6表達越低〔11〕；一項體外研究表明IGFBP6是鼻咽癌的抑癌因子，IGFBP-6陽性表達與降低局部復發和遠處轉移風險有關。Cox模型的多因素分析表明IGFBP-6是鼻咽癌局部復發和遠處轉移的獨立預后生物標志物〔12,13〕。

本研究通過免疫組織化學及RT-PCR法研究發現IGFBP-6蛋白及mRNA在乳腺癌組織中表達明顯低于癌旁正常組織，細胞中研究表明在乳腺癌細胞MCF-7中轉染IGFBP-6后可明顯抑制細胞增殖，本研究結果與Kaulsay等〔14〕結果一致，與良性乳腺腫瘤患者的血清相比，乳腺癌患者血清IGFBP-6濃度較低。

Xu等〔15〕發現IGFBP-6和趨化因子(C-C motif)配體(CCL)18是前列腺癌新的血清生物標志物。二乙基己烯雌酚處理后IGFBP-6水平升高，重組IGFBP-6對細胞增殖起抑制作用〔16〕。這些發現可提示IGFBP-6可能作為多種腫瘤的標志物〔17〕。本實驗通過對不同的乳腺癌細胞株進行轉染，轉染后的細胞降低了細胞的增殖率。表明IGFBP-6對乳腺癌的增殖起到抑制作用，但其主要機制還在進一步研究中，具體主要從兩個方面：一，抑制血管生成；二促進凋亡的發生。

本研究結果表明IGFBP6可能作為一種新的乳腺癌預后標志物。在臨床治療中起到一定的指導作用。