miR-326靶向PHB2對高糖誘導的腎小管上皮細胞損傷的影響

郭嘉鴻 魏華 徐可 梁照志

(新鄉市中心醫院,河南 新鄉 453000)

糖尿病腎病是臨床常見的疾病之一，隨著病情嚴重程度的增加導致終末期腎臟病的發生，因而急需尋找有效阻止糖尿病腎病進展的治療方法〔1〕。腎小管上皮細胞凋亡、間質炎性細胞浸潤等造成細胞外基質增多從而引起腎小管損傷、腎間質纖維化〔2〕。因而探究腎小管上皮細胞損傷機制成為糖尿病腎病的研究重點。微小RNA(miRNA)可能通過影響腎小管上皮細胞凋亡從而參與糖尿病腎病的發生〔3〕。微小RNA-326(miR-326)在1型糖尿病患者外周血單核細胞中上調表達，并可能參與糖尿病發生及發展過程〔4〕。miR-326在類風濕關節炎患者外周血單核細胞中高表達，其高表達量與類風濕性關節炎活動度相關〔5〕。通過生物信息學分析顯示PHB2可能是miR-326的靶基因，研究表明PHB2在系膜細胞缺氧模型中表達降低，并可能參與細胞缺氧損傷過程〔6〕。本研究通過高糖誘導腎小管上皮細胞模擬細胞損傷模型，觀察細胞中miR-326、PHB2的表達水平并分析其對細胞凋亡及炎性因子表達水平的影響。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 人腎小管上皮細胞HK-2(美國ATCC細胞庫)；Lipofectamine2000(美國Thermo Fisher)；anti-miR-326、anti-miR-NC、miR-326 mimics、miR-NC、si-PHB2、si-NC(上海吉瑪制藥)兔抗人B細胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相關X蛋白(Bax)抗體購自美國CST公司；pcDNA3.1(上海遠慕生物)；Trizol、反轉錄試劑盒、實時熒光定量試劑盒(大連寶生物工程)；白細胞介素(IL)-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α檢測試劑盒(上海百蕊生物)；細胞凋亡試劑盒(美國Sigma)；二抗購自武漢艾美捷科技有限公司；兔抗人PHB2抗體(美國Abcam)。

1.2方法

1.2.1實驗分組 取對數期HK-2細胞，設置對照組(葡萄糖濃度5.5 mmol/L的DMEM培養基)、高糖組(葡萄糖濃度25 mmol/L的DMEM培養基)〔7〕。取對數期HK-2細胞接種于24孔板，用Lipofectamine2000分別將anti-miR-NC、anti-miR-326、pcDNA、pcDNA-PHB2、anti-miR-326與si-NC、anti-miR-326與si-PHB2轉染至70%融合HK-2細胞，置于DMEM高糖培養基中培養24 h，分別記作高糖+anti-miR-NC組、高糖+anti-miR-326組、高糖+pcDNA組、高糖+pcDNA-PHB2組、高糖+anti-miR-326+si-NC組、高糖+anti-miR-326+si-PHB2組。

1.2.2qRT-PCR檢測細胞中miR-326、PHB2 mRNA的表達水平 采用Trizol法提取各組HK-2細胞的總RNA，逆轉錄后，擴增cDNA。qRT-PCR反應檢測miR-326、PHB2 mRNA的相對表達量。

1.2.3酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測IL-6、TNF-α含量 高糖孵育24 h后，收集細胞培養基上清液，按照試劑盒步驟檢測IL-6、TNF-α水平。

1.2.4流式細胞術檢測細胞凋亡率 每組收集1×104個HK-2細胞，按照凋亡檢測試劑盒說明書檢測細胞凋亡率。

1.2.5雙熒光素酶報告基因檢測miR-326的靶基因 WT-PHB2、MUT-PHB2分別與miR-NC、miR-326 mimics共轉染至HK-2細胞，轉染24 h后收集HK-2細胞，檢測其相對熒光素酶活性。分別將miR-NC、miR-326、anti-miR-NC、anti-miR-326轉染至腎小管上皮細胞，Western印跡檢測各組PHB2蛋白水平。

1.2.6Western印跡檢測PHB2、Bax、Bcl-2蛋白表達 收集各組HK-2細胞加入適量RIPA裂解液提取細胞總蛋白，按照電壓100 V、時間90 min進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，隨后按照電流300 mA、時間30 min進行轉膜。用一抗稀釋液(1∶1 000)4℃孵育10 h，再用二抗稀釋液(1∶2 000)25℃孵育1 h。ImageJ軟件分析各條帶灰度值。

1.3統計學處理 采用SPSS21.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結 果

2.1miR-326和PHB2在高糖誘導的腎小管上皮細胞損傷中的表達 與對照組相比，高糖組HK-2細胞中miR-326表達水平顯著升高(P<0.05)，PHB2 mRNA及蛋白表達量顯著降低(P<0.05)，見圖1、表1。

圖1 兩組PHB2蛋白表達

2.2抑制miR-326表達對高糖誘導的腎小管上皮細胞炎癥因子表達的影響 對照組比較，高糖組IL-6及TNF-α水平均顯著升高(P<0.05)；與高糖+anti-miR-NC組比較，高糖+anti-miR-326組IL-6、TNF-α水平均顯著降低(P<0.05)，見表1、表2。

2.3抑制miR-326表達對高糖誘導的腎小管上皮細胞凋亡的影響 與對照組比較，高糖組凋亡率及Bax水平均顯著升高(P<0.05)，而Bcl-2水平顯著降低(P<0.05)；與高糖+anti-miR-NC組比較，高糖+anti-miR-326組凋亡率及Bax水平均顯著降低(P<0.05)，而Bcl-2水平顯著升高(P<0.05)，見表1、表2、圖2、圖3。

1～4：對照組、高糖組、高糖+anti-miR-NC組、高糖+anti-miR-326組圖2 Western印跡檢測凋亡相關蛋白的表達

圖3 抑制miR-326表達對高糖誘導的腎小管上皮細胞凋亡的影響

2.4PHB2過表達對高糖誘導的腎小管上皮細胞損傷的影響 與高糖+pcDNA組相比，高糖+pcDNA-PHB2組細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白水平顯著升高(P<0.05)，IL-6和TNF-α水平、Bax蛋白水平顯著降低(P<0.05)，見圖4、圖5、表3。

1，2：高糖+pcDNA組、高糖+pcDNA-PHB2組圖4 Western印跡檢測各組PHB2、Bcl-2及Bax的表達

圖5 PHB2過表達對高糖誘導的腎小管上皮細胞凋亡的影響

2.5miR-326靶向調控PHB2的表達 miR-326與PHB2存在結合位點，見圖6。轉染miR-326可顯著降低野生型載體WT-PHB2的相對熒光素酶活性(P<0.05)，見表4。miR-326組PHB2蛋白(0.22±0.03)顯著低于miR-NC組(0.61±0.06，P<0.05)；anti-miR-326組PHB2蛋白(0.93±0.09)顯著高于anti-miR-NC組(0.58±0.05，P<0.05)，見圖7。

圖6 PHB2的3′UTR中含有與miR-326互補的核苷酸序列

表4 雙熒光素酶報告實驗

圖7 miR-326靶向調控PHB2的表達

2.6干擾PHB2表達逆轉了抑制miR-326表達對高糖誘導的腎小管上皮細胞損傷的作用 與高糖+ anti-miR-326+si-NC組相比，高糖+anti-miR-326+si-PHB2組細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白水平顯著降低(P<0.05)，IL-6和TNF-α水平、Bax蛋白水平顯著升高(P<0.05)，見圖8、圖9、表5。

1，2：高糖+anti-miR-326+si-NC組，高糖+anti-miR-326+si-PHB2組，下圖同圖8 Western印跡檢測PHB2及凋亡相關蛋白的表達

圖9 干擾PHB2表達逆轉了抑制miR-326表達對高糖誘導的腎小管上皮細胞凋亡的作用

3 討 論

miR-326在脂多糖誘導的急性肺損傷大鼠中表達上調，并可促進炎癥因子的表達〔8〕。研究表明miR-326在自身免疫性疾病中表達異常〔9〕。相關報道指出miR-326可通過激活核因子(NF)-κB信號通路從而促進炎癥反應的發生〔10〕。本研究結果顯示高糖誘導的腎小管上皮細胞中miR-326的表達上調，IL-6、TNF-α水平升高，與相關文獻報道結果相似〔11〕，抑制miR-326表達可明顯降低IL-6、TNF-α水平。本研究結果顯示高糖處理后，腎小管上皮細胞凋亡能力增強，與相關文獻報道結果相似〔12〕，而抑制miR-326表達可減弱細胞凋亡能力。

PHB2可調控細胞周期、細胞增殖及凋亡等多種細胞生物學過程，研究表明PHB2表達量降低與腎小管上皮細胞損傷有關〔13，14〕。

綜上，高糖處理后腎小管上皮細胞中miR-326表達上調，PHB2表達下調，抑制miR-326表達可靶向上調PHB2表達從而抑制高糖誘導的腎小管上皮細胞凋亡及炎癥反應的發生。