LncRNA BDNF-AS靶向miR-335-5p調控高糖誘導的小鼠足細胞損傷的分子機制

杜燕 李莎莎 徐夢露 劉曉茜 郭曉莉

(西安醫學院第一附屬醫院腎內科，陜西 西安 710077)

足細胞是腎小球臟層上皮細胞，是腎小球濾過的最后一道屏障，足細胞的損傷會導致蛋白濾出，形成蛋白尿，與腎小球疾病密切相關〔1〕。足細胞在糖尿病腎病的發生發展過程中起著重要作用〔2〕。因此，保護足細胞損傷可成為治療相關腎小球疾病的重要手段。LncRNA廣泛參與多種生物學過程，還與腎小球足細胞損傷、腎小管上皮細胞損傷、腎小球系膜細胞的增殖和纖維化、腎小球細胞外基質積聚等病理生理過程相關〔3〕。腦源性神經營養因子(BDNF)是一種多效性神經營養蛋白，有研究發現其對于腎小球發育、形態和功能至關重要，可有效修復足細胞損傷〔4，5〕。BDNF反義因子(BDNF-AS)是一種LncRNA，有研究發現下調LncRNA BDNF-AS的表達可保護高糖誘導的人視網膜色素上皮細胞凋亡〔6〕。沉默LncRNA BDNF-AS通過抑制細胞凋亡和氧化應激可減弱PC12細胞中Aβ25～35誘導的神經毒性〔7〕。研究表明miRNA可通過調控足細胞在腎小球疾病發生發展中發揮重要作用〔8〕。高糖狀態下，miR-335-5p促進成骨細胞的增殖，抑制細胞凋亡〔9〕。miR-335通過抑制超氧化物歧化酶(SOD)2表達增加了氧化誘導的視網膜色素上皮細胞損傷〔10〕。然而LncRNA BDNF-AS和miR-335-5p對足細胞損傷的影響及其機制還尚未可知。本實驗通過高糖誘導小鼠腎臟足細胞MPC5建立足細胞損傷模型，研究LncRNA BDNF-AS對足細胞損傷的影響及其機制是否與miR-335-5p相關。

1 材料與方法

1.1材料 小鼠腎臟足細胞系MPC5購自上海名勁生物科技有限公司；胎牛血清、DMEM培養基、胰蛋白酶均購自美國Sigma公司；LipofectamineTM2000轉染試劑盒、RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒、熒光定量試劑盒均購自美國Invitrogen公司；二喹啉甲酸(BCA)試劑盒、RIPA蛋白裂解液、聚偏氟乙烯(PVDF)膜、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)試劑盒均購自上海碧云天生物技術有限公司；膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)和碘化丙啶(PI)試劑盒、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自北京Solarbio公司；抗體購自北京博奧森生物科技有限公司；載體質粒購自上海斯信生物科技有限公司；Light Cycler480熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)儀購自上海仁科生物科技有限公司；流式細胞儀、Power Pac蛋白電泳儀及Gel Doc XR+凝膠顯示系統購自美國BD公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養與分組 MPC5細胞在37℃、5%CO2，含10%胎牛血清的DMEM完全培養液中培養，每隔2～3 d傳代1次，取對數生長期細胞無血清饑餓培養12 h后用終濃度為30 mmol/L的D-葡萄糖溶液刺激培養細胞48 h作為高糖(HG)組，同時以終濃度為5 mmol/L的D-葡萄糖溶液處理細胞作為正常對照(NG)組。將si-NC、si-BDNF-AS、miR-NC、miR-335-5p分別轉染至MPC5細胞中再用HG處理，記為HG+si-NC組、HG+si-BDNF-AS組、HG+miR-NC組、HG+miR-335-5p組。將pcDNA、pcDNA-BDNF-AS、si-NC、si-BDNF-AS轉染至MPC5細胞中，記為pcDNA組、pcDNA-BDNF-AS組、si-NC組和si-BDNF-AS組。將si-BDNF-AS與anti-miR-NC、annti-miR-335-5p分別共同轉染至MPC5細胞中再用HG處理，記為HG+si-BDNF-AS+anti-miR-NC組、HG+si-BDNF-AS+antimiR-335-5p組；轉染均按照LipofectamineTM2000轉染試劑盒說明進行。

1.2.2實時熒光定量(qRT)-PCR檢測miR-335-5p和BDNF-AS表達水平 細胞培養48 h后提取總RNA，反轉錄成cDNA，再按照熒光定量試劑盒使用說明進行PCR擴增，每個樣品重復3次，反應條件為95℃ 30 s，60℃ 30 s；72℃ 30 s，共40個循環；72℃延長5 min。相對表達量采用2-△△Ct法計算。miR-335-5p和BDNF-AS分別以U6和GAPDH為內參，miR-335-5p正向引物：5′-GCGTCAAGAGCAATAACG-3′，反向引物：5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；U6正向引物：5′-TGCAGAGGATCTAATT-3′，反向引物：5′-GAAAGACCAGTCCAAGTCC-3′。BDNF-AS正向引物：5′-TACCACAAGGTACCAACCATATATG-3′，反向引物：5′-CATGTGGTTCTGTTTCAATGCCC-3′；GAPDH正向引物：5′-CCCCATACACAGTGTTAGCC-3′，反向引物：5′-GAGTGATTTTCCCGTCC-3′；引物均由上海生工生物公司合成。

1.2.3Western印跡檢測podocin、nephrin、B細胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相關x蛋白(Bax)、酶切含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)3蛋白表達 細胞培養48 h后提取總蛋白，BCA試劑盒測定蛋白濃度。將蛋白樣品經SDS-PAGE后轉至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入一抗(1∶1 000)，4℃孵育過夜，TBST洗膜；加入二抗(1∶2 000)室溫孵育2 h，TBST洗滌3次，后顯影，定影，用Quantity One凝膠分析軟件處理，測定各組蛋白條帶的灰度值，以目的條帶和GAPDH條帶的比值作為蛋白水平。每個蛋白樣品重復3次。

1.2.4流式細胞術檢測細胞凋亡 細胞培養48 h后用不含EDTA的胰酶消化，離心收集后用磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗2次，重懸細胞。先后加入Annexin V-FITC和PI各5 μl避光孵育30 min。用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。實驗重復3次。

1.2.5熒光素酶實驗檢測BDNF-AS對miR-335-5p的靶向調控 構建野生型和突變型基因靶點BDNF-AS的3′UTR熒光素酶表達載體WT-BDNF-AS和MUT-BDNF-AS，用LipofectamineTM2000將miR-NC和miR-335-5p分別轉染至MPC5細胞中，再將WT-BDNF-AS和MUT-BDNF-AS分別轉染至其中，培養48 h后各組細胞中加入熒光素酶試劑盒酶反應底物，充分作用后，測定各組細胞中相對熒光強度。實驗重復3次。

1.3統計學方法 采用SPSS20.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結 果

2.1干擾LncRNA BDNF-AS和miR-335-5p對HG誘導的小鼠足細胞中podocin及nephrin蛋白表達的影響 與NG組相比，HG組足細胞LncRNA BDNF-AS表達水平顯著升高，miR-335-5p、podocin、nephrin蛋白表達水平顯著降低(均P<0.05)；與HG+si-NC組相比，HG+si-BDNF-AS組LncRNA BDNF-AS表達水平顯著降低，podocin、nephrin蛋白表達水平顯著升高(均P<0.05)。見表1、圖1。

圖1 Western印跡檢測podocin及nephrin蛋白的表達

2.2干擾LncRNA BDNF-AS表達對HG誘導的小鼠足細胞凋亡的影響 與NG組相比，HG組足細胞凋亡率顯著升高，Bcl-2蛋白表達水平顯著降低，Bax、酶切caspase3蛋白表達水平顯著升高(均P<0.05)；與HG+si-NC組相比，HG+si-BDNF-AS組細胞凋亡率顯著降低，Bcl-2蛋白表達水平顯著升高，Bax、酶切caspase3蛋白表達水平顯著降低(均P<0.05)。見表1、圖2，圖3。

1～4：NG組、HG組、HG+si-NC組、HG+si-BDNF-AS組圖2 Western印跡檢測凋亡相關蛋白的表達

圖3 干擾LncRNA BDNF-AS表達對HG誘導的小鼠足細胞凋亡的影響

2.3miR-335-5p過表達對HG誘導的小鼠足細胞損傷的影響 與HG+miR-NC組相比，HG+miR-335-5p組miR-335-5p表達水平顯著升高，podocin、nephrin蛋白表達水平顯著升高，細胞凋亡率顯著降低，Bcl-2蛋白表達水平顯著升高，Bax、酶切caspase3蛋白表達水平顯著降低(均P<0.05)。見圖4、圖5，表2。

圖4 Western印跡檢測podocin、nephrin和凋亡相關蛋白的表達

圖5 miR-335-5p過表達對HG誘導的小鼠足細胞凋亡的影響

2.4LncRNA BDNF-AS靶向調控miR-335-5p的表達 LncBase在線軟件預測到BDNF-AS與miR-335-5p存在結合位點。見圖6。轉染野生型和突變型表達載體WT-BDNF-AS和MUT-BDNF-AS后，相較于miR-NC組，miR-335-5p組WT-BDNF-AS鼠足細胞的熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)。見表3。相較于si-NC組miR-335-5p表達水平(1.01±0.09)，si-BDNF-AS組(2.36±0.23)顯著升高(P<0.05)；相較于pcDNA組miR-335-5p表達水平(1.00±0.08))，pcDNA-BDNF-AS組(0.52±0.05)顯著降低(均P<0.05)。表明BDNF-AS可靶向調控miR-335-5p。

圖6 BDNF-AS的序列中含有與miR-335-5p互補的核苷酸序列

表3 雙熒光素酶報告實驗

2.5抑制miR-335-5p表達逆轉了干擾LncRNA BDNF-AS表達對HG誘導的小鼠足細胞損傷的作用 與HG+si-BDNF-AS+anti-miR-NC組相比，HG+si-BDNF-AS+anti-miR-335-5p組miR-335-5p表達水平顯著降低，podocin、nephrin蛋白表達水平顯著降低，細胞凋亡率顯著升高，Bcl-2蛋白表達水平顯著降低，Bax、酶切caspase3蛋白表達水平均顯著升高(均P<0.05)。見圖7、表4、圖8。

1～2：HG+si-BDNF-AS+anti-miR-NC組、HG+si-BDNF-AS+anti-miR-335-5p組；下圖同圖7 Western印跡檢測各組podocin、nephrin和凋亡相關蛋白的表達

圖8 抑制miR-335-5p表達逆轉了干擾LncRNA BDNF-AS表達對HG誘導的小鼠足細胞損傷的作用

3 討 論

足突之間裂孔膜蛋白的完整性是腎小球機械過濾屏障的關鍵，其蛋白表達下降會引起足細胞結構和功能障礙從而導致尿蛋白的產生〔11〕。裂孔膜蛋白podocin、nephrin是維持足細胞裂孔隔膜蛋白形態結構的完整性，使腎小球發揮正常的濾過功能，從而減少蛋白尿漏出的重要分子〔12〕。本研究結果說明HG導致了足細胞損傷，使其產生功能障礙。

抑制LncRNA BDNF-AS可保護視網膜神經節細胞缺血性損傷〔13〕。抑制LncRNA BDNF-AS可挽救缺氧/復氧受損鼠心肌細胞的細胞死亡和凋亡〔14〕。抑制LncRNA BDNF-AS通過下調miR-130b-5p在急性脊髓損傷中抑制神經細胞凋亡〔15〕。本研究結果說明干擾LncRNA BDNF-AS表達可抑制HG誘導的足細胞凋亡，保護HG誘導的足細胞損傷。

研究報道miR-335-5p靶向抑制血清可溶性klotho蛋白(sKlotho)并促進氧化應激介導的內皮細胞衰老〔16〕。敲低SLCO4A1-AS1通過miR-335-5p抑制膀胱癌的生長和侵襲〔17〕。 本研究結果說明過表達miR-335-5p可抑制HG誘導的足細胞凋亡，保護HG誘導的足細胞損傷，提示LncRNA BDNF-AS可能通過調控miR-335-5p保護HG誘導的足細胞損傷。綜上，HG作用的小鼠足細胞中LncRNA BDNF-AS低表達，過表達LncRNA BDNF-AS可抑制細胞凋亡，保護HG誘導的小鼠足細胞損傷，其機制可能與miR-335-5p的表達相關。