miR-18a-5p調控PSORS1C1對類風濕關節炎成纖維細胞樣滑膜細胞遷移、侵襲及炎癥反應的影響

蔣磊 陳漢玉 彭旭玲 胡周靜 羅茜 張永紅 蘭培敏

(十堰市太和醫院慢性病1病區，湖北 十堰 442099)

類風濕關節炎是一種慢性自身免疫性疾病，患者具有極高致殘率且嚴重降低生存質量，研究表明類風濕關節炎與細胞內因子及蛋白表達異常有關〔1,2〕。類風濕關節炎患者滑膜成纖維細胞(SFs)可為關節腔及其周圍組織提供營養，但SFs異常活化可促進白細胞介素(IL)-1等炎癥因子釋放進而破壞關節組織〔3〕。因而尋找SFs活化相關基因并探究其可能作用機制對治療類風濕關節炎具有重要意義。研究表明微小RNA(miRNA)可調節細胞生長及發育等過程，miRNA表達異常與類風濕關節炎發生及發展密切相關，但仍有部分miRNA在類風濕關節炎發生過程中的分子機制尚未完全闡明〔4〕。研究發現miR-18a在類風濕關節炎關節成纖維樣滑膜細胞中表達降低，其可能通過調控炎性細胞因子分泌而參與類風濕關節炎的發病機制〔5〕。但miR-18a-5p對類風濕關節炎成纖維細胞樣滑膜細胞遷移、侵襲及炎癥反應的影響及其機制尚未可知。靶基因預測顯示銀屑病易感基因 1 候選基因(PSORS1C)1可能為miR-18a-5p的靶基因，研究發現PSORS1C1在類風濕關節炎患者滑膜組織中上調表達，PSORS1C1可能參與滑膜組織的病變，但關于其是否通過其他途徑影響類風濕關節炎發生或發展尚未闡明〔6,7〕。因此，本研究分析miR-18a-5p對類風濕關節炎關節成纖維樣滑膜細胞遷移、侵襲及炎癥反應的影響，探究其是否可調控PSORS1C1表達及其可能作用機制。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 MH7A購自廣州吉妮歐生物科技有限公司；正常人關節成纖維樣滑膜細胞HFLS購自江蘇無錫菩禾生物技術有限公司；10%胎牛血清DMEM培養基均購自美國Gibco公司；RNA提取試劑盒購自北京百泰克生物技術有限公司；miR-18a-5p mimics及陰性對照均購自北京英格恩生物科技有限公司；miR-18a-5p抑制物(anti-miR-18a-5p)及其陰性對照(anti-miR-NC)、siRNA PSORS1C1(si-PSORS1C1)及其陰性對照(si-NC)均購自廣州銳博生物科技有限公司；兔抗人基質金屬蛋白酶(MMP)-2、鈣黏附蛋白-E(E-cadherin)、PSORS1C1抗體與辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔二抗均購自美國CST公司；Transwell小室購自北京萌壯科技有限公司；基質膠購自美國BD公司；蛋白提取試劑盒購自江蘇凱基生物技術股份有限公司；IL-1、IL-2檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；Lipofectamine2000購自美國Invitrogen公司；反轉錄試劑盒及qRT-聚合酶鏈反應(PCR)試劑盒均購自大連寶生物工程有限公司。

1.2方法

1.2.1細胞轉染及實驗分組 收集對數生長期MH7A細胞，待細胞生長融合至50%時進行轉染，細胞隨機分為miR-18a-5p組(轉染miR-18a-5p mimics)、miR-NC組(轉染陰性對照)、si-PSORS1C1組(轉染siRNA PSORS1C1)、si-NC組(轉染陰性對照si-NC)、miR-18a-5p+pcDNA3.1-PSORS1C1組(轉染miR-18a-5p mimics后再轉染PSORS1C1過表達質粒)、miR-18a-5p+pcDNA3.1組(轉染miR-18a-5p mimics后再轉染空質粒)，轉染后6 h更換DMEM完全培養基，繼續培養48 h，將轉染成功的細胞用于實驗。

1.2.2qRT-PCR檢測細胞中miR-18a-5p表達水平 按照RNA提取試劑盒提取細胞總RNA，反轉錄合成第1鏈cDNA，qRT-PCR體系：染科法實時熒光定量試劑盒10 μl，cDNA 2 μl，上下游引物各0.8 μl，熒光定量PCR多比染料0.4 μl，ddH2O 補足體系至20 μl。qRT-PCR條件：95℃預變性3 min循環1次，95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s(共循環40次)。采用2-ΔΔCt法計算miR-18a-5p的相對表達量。

1.2.3Transwell實驗檢測細胞遷移及侵襲 細胞侵襲實驗：取對數生長期各組MH7A細胞，加入無血清DMEM培養基重懸細胞，調整細胞濃度為1×108個/L，用孔徑8 μm的聚碳酸酯微膜孔將其分隔為上室與下室，小室的上室平鋪稀釋基質膠，取500 μl含有10%胎牛血清的DMEM培養基加入洗掃灰的下室，取300 μl細胞懸液加入小室的上室，放入37℃、體積分數5%CO2培養箱繼續培養24 h，取出聚碳酸酯微膜，使用棉簽擦去內層細胞，PBS洗滌，多聚甲醛固定20 min，結晶紫溶液染色20 min，顯微鏡下隨機選取10個視野觀察計數。細胞遷移實驗：小室的上室不用平鋪稀釋基質膠，其余步驟同細胞侵襲實驗。

1.2.4熒光素酶報告基因檢測 構建含有miR-18a-5p與PSORS1C1結合位點及其突變位點的熒光素酶報告基因載體，分別為野生型WT-PSORS1C1、突變型MUT-PSORS1C1，將WT-PSORS1C1、MUT-PSORS1C1分別與miR-18a-5p mimics、miR-NC共轉染MH7A細胞，繼續培養24 h，參照熒光素酶活性檢測試劑盒說明書檢測MH7A細胞熒光素酶活性。

1.2.5Western印跡檢測PSORS1C1、MMP-2、E-cadherin蛋白表達 收集各組MH7A細胞，加入蛋白裂解液，離心后提取細胞總蛋白，鄰苯三酚紅鉬法測定蛋白濃度，高溫煮沸，蛋白變性，取30 μg蛋白上樣，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，反應結束后將其轉移硝酸纖維素膜，室溫條件下用5%脫脂奶粉封閉1 h，加一抗，4℃孵育24 h，TBST清洗，加入二抗，室溫孵育2 h，TBST洗膜，滴加電化學(ECL)顯影，置于凝膠呈現系統掃描，Quantityone軟件檢測條帶灰度值。

1.2.6檢測細胞上清液中IL-1、IL-2水平 收集各組細胞上清液，按照IL-1、IL-2檢測試劑盒說明書檢測細胞上清液中IL-1、IL-2水平，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.3統計學處理 采用SPSS21.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結 果

2.1miR-18a-5p在細胞HFLS和MH7A中的表達 與HFLS細胞中miR-18a-5p表達水平(0.92±0.09)相比，MH7A細胞顯著降低(0.23±0.02，P<0.05)。

2.2過表達miR-18a-5p對細胞MH7A遷移、侵襲及炎癥因子的影響 與miR-NC組相比，miR-18a-5p組遷移及侵襲細胞數均顯著減少，IL-1水平與MMP-2蛋白表達均顯著降低(P<0.05)，而IL-2水平與E-cadherin蛋白表達均顯著升高(P<0.05)，見圖1、表1、圖2。表明miR-18a-5p過表達可顯著抑制MH7A細胞遷移及侵襲，并可有效減緩炎癥反應。

圖1 過表達miR-18a-5p對細胞MH7A遷移、侵襲的影響(結晶紫，×200)

圖2 過表達miR-18a-5p對細胞MH7A遷移、侵襲蛋白表達的影響

2.3miR-18a-5p靶向、調控PSORS1C1的表達 Targetscan靶基因預測網站顯示PSORS1C1的3′UTR區存在miR-18a-5p結合位點，見圖3。雙熒光素酶報告基因實驗顯示，相比共轉染miR-NC、WT-PSORS1C1的MH7A細胞，共轉染miR-18a-5p mimics、WT-PSORS1C1的MH7A細胞熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)；而與共轉染miR-NC、MUT-PSORS1C1的MH7A細胞相比，共轉染miR-18a-5p mimics、MUT-PSORS1C1的MH7A細胞熒光素酶活性無顯著性變化(P>0.05)，見表2。表明miR-18a-5p可靶向結合PSORS1C1。Western印跡檢測結果顯示，與miR-NC組PSORS1C1蛋白表達水平(0.73±0.07)相比，miR-18a-5p組(0.14±0.01)顯著降低(P<0.05)；與anti-miR-NC組RSORS1C1蛋白表達水平(0.74±0.07)相比，anti-miR-18a-5p組(1.15±0.11)顯著升高(P<0.05)，見圖4。

1～4:miR-NC組，miR-18a-5p組，anti-miR-NC組，anti-miR-18a-5p組圖3 miR-18a-5p靶向PSORS1C1

表2 雙熒光素酶報告實驗

圖4 miR-18a-5p調控PSORS1C1的表達

2.4抑制PSORS1C1對細胞MH7A遷移、侵襲及炎癥因子的影響 與si-NC組相比，si-PSORS1C1組遷移及侵襲細胞數均顯著減少(P<0.05)，IL-1水平與MMP-2蛋白表達水平均顯著降低(P<0.05)，而IL-2水平與E-cadherin蛋白表達水平均顯著升高(P<0.05)，見圖5、表3。

圖5 抑制PSORS1C1對細胞MH7A遷移、侵襲蛋白表達的影響

2.5過表達PSORS1C1能逆轉miR-18a-5p對細胞MH7A遷移、侵襲及炎癥因子的影響 與miR-18a-5p+pcDNA3.1組相比，miR-18a-5p+pcDNA3.1-PSORS1C1組遷移及侵襲細胞數均顯著增加(P<0.05)，IL-1水平與MMP-2蛋白表達水平均顯著升高(P<0.05)，而IL-2水平與E-cadherin蛋白表達水平均顯著降低(P<0.05)，見表4、圖6。

1～2：miR-18a-5p+pcDNA3.1組;miR-18a-5p+pcDNA3.1-PSORS1C1組圖6 過表達PSORS1C1能逆轉miR-18a-5p對細胞MH7A遷移、侵襲蛋白表達的影響

3 討 論

類風濕關節炎主要以手、足小關節的炎癥反應為主要病理特征，常伴有關節外器官受累、免疫功能指標異常等導致患者關節畸形甚至誘發功能障礙〔8〕。Toll樣受體可通過促進炎癥因子的釋放而促進類風濕關節炎發生及發展〔9〕。研究表明部分miRNA可通過抑制SFs增殖及侵襲能力進而抑制類風濕關節炎的發生〔10〕。

miR-18a-5p在動脈粥樣硬化疾病等其他心血管疾病中的表達水平降低，并可能作為臨床診斷心血管疾病發生的有效指標〔11〕。沉默LncRNA H19可通過上調miR-18a-5p表達而抑制胎兒生長受限中絨毛外滋養層細胞增殖及侵襲〔12〕。LncRNA GAS5通過負調節miR-18a-5p而調控膠質瘤細胞增殖、遷移及侵襲〔13〕。miR-18a-5p通過調控Notch2途徑而抑制內皮-間質轉化及心臟纖維化〔14〕。研究表明MMP-2、E-cadherin表達異常與細胞遷移及侵襲能力有關，MMP-2與細胞遷移及侵襲能力呈正相關，而E-cadherin與細胞遷移及侵襲能力呈負相關〔15,16〕。提示miR-18a-5p過表達可能通過抑制MMP-2表達及上調E-cadherin表達進而抑制MH7A細胞遷移及侵襲。已有報道指出IL-1可誘導類風濕關節炎關節滑膜細胞增殖并增強IL-6等炎性因子的作用，IL-2屬于免疫調節因子并可抑制促炎性細胞因子及趨化因子的釋放，同時還可抑制MMPs表達進而保護軟骨細胞〔17〕。提示miR-18a-5p過表達可通過調節細胞免疫功能進而抑制類風濕關節炎關節滑膜細胞遷移及侵襲。

PSORS1C1基因多態性與類風濕關節炎密切相關，還可能與強直性脊柱炎發生及發展有關〔18～20〕。本研究結果提示miR-18a-5p 過表達可通過下調PSORS1C1表達而降低MH7A細胞遷移、侵襲能力，并減輕機體炎癥反應程度。

綜上，miR-18a-5p 可有效抑制SFs遷移及侵襲能力，減輕炎癥反應，在類風濕關節炎發生過程中發揮重要調控作用，其作用機制與下調PSORS1C1的表達有關。