miR-375調控PIAS1對急性胰腺炎腺泡細胞增殖、凋亡的影響

杜慧清 杜慧靜 耿棟棟

(1新鄉市中心醫院急診科，河南 新鄉 453000；2新鄉醫學院第三附屬醫院急診科)

急性胰腺炎(AP)是急診科常見急腹癥的主要類型，根據疾病嚴重程度分為輕度、中度及重度，而重度AP患者治療后預后較差且具有較高的死亡率〔1〕。胰腺腺泡細胞凋亡與增殖比例失衡是導致AP發生及發展的重要原因之一〔2〕。因而如何抵抗胰腺腺泡細胞凋亡及促進細胞增殖對研制AP新型治療藥物有重要參考價值。研究表明在AP大鼠胰腺中信號轉導和轉錄激活子1的活化抑制蛋白(PIAS1)的表達水平顯著降低，其表達水平與AP病情嚴重度呈負相關，并可作為預測病情嚴重程度及預后的重要指標〔3〕。沉默PIAS1基因表達可增強雨蛙肽活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)-3凋亡途徑而促使胰腺腺泡細胞凋亡進而促進炎癥的發生〔4,5〕，結果表明PIAS1可參與AP發生及發展過程，但關于其具體作用機制尚未完全闡明。相關研究對胰腺炎組、正常組進行芯片分析發現在AP患者血清中微小RNA-375(miR-375)表達上調，進一步研究發現miR-375可通過靶向YAP1抑制胰腺細胞增殖〔6,7〕。但miR-375對AP腺泡細胞的影響及其機制研究尚未完全闡明。經靶基因預測軟件分析發現PIAS1可能是miR-375的靶基因，由此猜測miR-375可能通過調控PIAS1表達進而參與AP發生及發展過程。因此，本研究用雨蛙素(CAE)處理胰腺腺泡細胞株 AR42J構建AP模型，觀察miR-375、PIAS1表達，并分析下調miR-375表達后其對AR42J細胞增殖及凋亡的影響，初步探討其是否通過調控PIAS1表達而發揮作用。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 胰腺腺泡細胞株 AR42J購自美國ATCC細胞保藏中心。RPMI1640培養基購自美國Gibco公司；CAE購自上海博研生物工程研究中心；胰蛋白酶與胎牛血清均購自武漢碧云天生物有限公司；Trizol試劑與Lipofectamine2000轉染試劑均購自美國Invitrogen公司；膜聯蛋白V(Annexin V)-異硫氰酸熒光素(FITC)細胞凋亡試劑盒購自美國BD公司；反轉錄試劑盒購自上海生工生物工程股份有限公司；實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；RIPA細胞裂解液購自上海博彩生物科技有限公司；兔抗鼠B細胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相關X蛋白(Bax)多克隆抗體與辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔IgG二抗均購自美國Santa Cruz公司；兔抗鼠CyclinD1、P21一抗購自武漢博士德生物技術公司；GAPDH一抗購自美國Abcam公司；噻唑藍(MTT)檢測試劑盒購自上海士鋒生物科技有限公司；miR-375模擬物(miR-375 mimics)、miR-375抑制劑(anti-miR-375)及其相應陰性對照均購自西安沃爾森生物技術有限公司；si-PIAS1、si-NC均購自廣州銳博生物科技有限公司；Gene TailorTMSite-Directed Mutagenesis System試劑盒購自美國Invitrogen公司；雙熒光素酶報告基因檢測系統購自美國Biovision公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養、轉染及分組 胰腺泡AR42J細胞放入含有10%胎牛血清、青霉素及鏈霉素的RPMI1640培養液中培養，培養條件為37℃、5%CO2恒溫培養箱，待細胞穩定傳代2～3代后進行轉染。收集處于對數生長期AR42J細胞，胰蛋白酶消化細胞后接種于6孔板，轉染前1 d更換不含血清的RPMI1640培養基，不含血清的RPMI1640培養基分別稀釋Lipofectamine2000轉染試劑、anti-miR-NC、anti-miR-375、miR-NC、miR-375、si-NC、si-PIAS1，最終促使其終濃度為100 nmol/L的轉染混合液，將anti-miR-NC、anti-miR-375、miR-NC、miR-375分別轉染至AR42J細胞，分別為anti-miR-NC組、anti-miR-375組、miR-NC組、miR-375組，同時將anti-miR-375與si-NC、si-PIAS1分別共轉染至AR42J細胞，分別為anti-miR-375+si-NC組、anti-miR-375+si-PIAS1組。轉染后放入37℃、5%CO2恒溫培養箱，培養6 h后將培養基更換為RPMI1640完全培養基繼續培養48 h。

1.2.2構建AP模型 造模前1 d將生長狀態良好的AR42J細胞以每孔5.5×104個細胞的密度接種于6孔板，每孔加入RPMI1640完全培養基(1 ml/孔)，放入37℃、5%CO2恒溫培養箱孵育24 h，加入10 nmol/L CAE處理細胞24 h〔8〕，振蕩混勻，繼續培養48 h后收集AR42J細胞，同時將CAE處理后的AR42J細胞作為AR42J+CAE組，未經CAE處理的AR42J細胞作為AR42J組。1.2.1各轉染組轉染后12 h，用濃度為10 nmol/L的CAE刺激細胞24 h，繼續培養48 h后收集細胞進行后續研究。

1.2.3qRT-PCR實驗 收集各組AR42J細胞置于1.5 ml離心管內，經低溫快速離心后棄上清，預冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細胞，加入1 ml Trizol試劑提取細胞總RNA，應用NanoDrop2000測定RNA濃度，采用反轉錄試劑盒合成cDNA，以cDNA為模板進行qRT-PCR，反應體系為20 μl，SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2×)10 μl，cDNA 2 μl，上下游引物各0.8 μl，ddH2O補足至20 μl。擴增條件為95℃預變性5 min循環1次，95℃變性30 s循環35次，60℃退火30 s循環35次，72℃延伸30 s循環35次。miR-375以U6為內參基因，PIAS1以GAPDH為內參基因，采用2-ΔΔCt法計算miR-375、PIAS1 mRNA相對表達量。每組實驗均設置3次重復。

1.2.4Western印跡 取對數生長期AR42J細胞，預冷PBS洗滌細胞，4℃，1 200 r/min轉速離心5 min，離心半徑 6 cm，離心后棄上清，加入RIPA細胞裂解液提取細胞總蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白濃度，配置十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離膠與濃縮膠，將配置完成的SDS-PAGE凝膠放入含有1×蛋白電泳緩沖液的電泳槽內，蛋白樣本上樣(50 μg/孔)，電泳反應條件為分離膠前90 V 30 min，隨后120 V 90 min，濕轉膜儀將蛋白凝膠轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，2 h后取膜置于5%脫脂奶粉封閉液內室溫條件下封閉2 h，加入PIAS1、CyclinD1、P21、Bcl-2、Bax蛋白(稀釋比均為1∶500)及GAPDH一抗(稀釋比1∶1 000)，4℃條件下孵育過夜，次日用TBST洗滌3次×10 min，加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的IgG二抗(稀釋比1∶5 000)，室溫條件下孵育60 min，TBST洗滌3次×10 min，滴加ECL試劑顯影，置于凝膠成像分析系統曝光并掃描圖片，應用Quantity One軟件分析蛋白條帶灰度值，各蛋白均以GAPDH為內參進行半定量分析。每組實驗均設置3次重復。

1.2.5細胞增殖實驗 取各組對數生長期AR42J細胞，以每孔3×104個細胞的密度接種于96孔板，加入適量RPMI1640完全培養基，培養時間為24 h、48 h、72 h時向每孔加入質量濃度為5 g/L的MTT溶液20 μl，放入37℃、 5%CO2培養箱內繼續培養4 h，更換培養基，每孔加入150 μl的二甲基亞砜(DMSO)溶液，置于搖床內振蕩混勻，應用酶標儀檢測各孔在490 nm處的光密度值(OD)。

1.2.6流式細胞議檢測細胞凋亡 取1.2.1與1.2.2中各組對數生長期的AR42J細胞，加入100 μl結合緩沖液重懸細胞，加入5 μl Annexin V-FITC，室溫條件下避光孵育15 min，加入5 μl PI染色液，避光振蕩10 min充分混勻，加入400 μl結合緩沖液，充分混勻，置于流式細胞儀檢測AR42J細胞凋亡率。

1.2.7雙熒光素酶報告基因實驗 利用TargetScan 靶基因預測庫預測miR-375的靶基因，將含有miR-375與PIAS1 3′UTR的結合位點序列的PCR擴增產物載入pGL3質粒的Xbal酶切位點構建pGL3-WT-PIAS1野生型報告基因質粒，應用Gene TailorTMSite-Directed Mutagenesis System試劑盒突變miR-375與PIAS1 3′UTR的結合位點，構建pGL3-MUT-PIAS1突變型真核表達載體。取AR42J細胞分別轉染后分為4組：miR-NC組(轉染野生型WT-PIAS1質粒與miR-NC)；miR-375組(轉染野生型WT-PIAS1質粒與miR-375 mimics)；miR-NC組(轉染野生型MUT-PIAS1質粒與miR-NC)；miR-375組(轉染野生型MUT-PIAS1質粒與miR-375 mimics)。細胞轉染24 h后用雙熒光素酶報告基因檢測系統檢測各組細胞熒光素酶活性。

1.3統計學方法 應用SPSS21.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結 果

2.1miR-375、PIAS1在胰腺腺泡細胞AR42J和CAE作用的AR42J細胞中的表達 AR42J+CAE組miR-375明顯高于AR42J組，而PIAS1蛋白水平明顯低于AR42J組(均P<0.05)，見圖1、表1。表明CAE可促使AR42J細胞中miR-375的表達上調，而抑制PIAS1表達。

圖1 PIAS1蛋白的表達

表1 miR-375、JAK2在胰腺腺泡細胞AR42J和CAE作用的AR42J細胞中的表達

2.2抑制miR-375對CAE作用的AR42J細胞增殖的影響 通過向AR42J細胞中轉染anti-miR-375及其陰性對照，并用CAE刺激后構建AP模型，用qRT-PCR實驗檢測轉染效率，結果顯示，anti-miR-375組AR42J細胞中miR-375的表達水平顯著低于anti-miR-NC組(P<0.05)，表明轉染成功。MTT實驗檢測細胞增殖，與anti-miR-NC組比較，anti-miR-375組AR42J細胞增殖活性均明顯增強(均P<0.05)。表明抑制miR-375表達可有效促進AR42J細胞增殖。Western印跡檢測細胞增殖相關蛋白表達，anti-miR-375組AR42J細胞中CyclinD1表達水平較anti-miR-NC組顯著升高(P<0.05)，而P21表達水平明顯降低(P<0.05)。見圖2、表2。表明抑制miR-375表達可通過上調CyclinD1表達及下調P21表達進而促進AR42J細胞增殖。

圖2 增殖相關蛋白的表達

2.3抑制miR-375對CAE作用的AR42J細胞凋亡的影響 流式細胞儀檢測AR42J細胞凋亡，結果顯示，anti-miR-375組細胞凋亡率明顯低于anti-miR-NC組(P<0.05)。表明抑制miR-375表達可抑制AR42J細胞凋亡。Western印跡檢測細胞凋亡相關蛋白表達，結果顯示，與anti-miR-NC組比較，anti-miR-375組AR42J細胞中Bcl-2表達水平顯著升高，而Bax表達水平顯著降低(均P<0.05)。表明抑制miR-375表達可通過上調Bcl-2表達及下調Bax表達進而抑制AR42J細胞凋亡。見圖3、表3。

A：抑制miR-375對CAE作用的AR42J細胞凋亡的影響；B：抑制miR-375對CAE作用的AR42J細胞凋亡蛋白表達的影響圖3 抑制miR-375對CAE作用的AR42J細胞凋亡的影響

表3 抑制miR-375對CAE作用的AR42J細胞凋亡的影響

2.4miR-375靶向、調控PIAS1 TargetScan靶基因預測數據庫對miR-375的靶基因進行預測，檢索結果發現miR-375與PIAS1的3′UTR序列存在結合位點，見圖4。雙熒光素酶報告基因實驗顯示共轉染miR-375 mimics、野生型WT-PIAS1載體的實驗組中，miR-375組WT-PIAS1顯著低于miR-NC組(P<0.05)，兩組MUT-PIAS1比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見表4。表明miR-375可直接靶向PIAS1。進一步研究結果顯示，miR-375組PIAS1 mRNA及蛋白的表達水平顯著低于miR-NC組(P<0.05)，anti-miR-375組PIAS1 mRNA及蛋白的表達水平顯著高于anti-miR-NC組(P<0.05)，見圖5、表5。表明miR-375可靶向調控PIAS1的表達。

圖4 PIAS1的3′UTR含有miR-375的互補序列

表4 雙熒光素酶報告實驗

圖5 miR-375調控PIAS1的表達

表5 miR-375調控PIAS1的表達

2.5抑制PIAS1表達能逆轉抑制miR-375對CAE作用的AR42J細胞增殖的促進作用 為明確抑制miR-375表達是否通過上調PIAS1表達進而促進CAE作用的AR42J細胞增殖，通過回復實驗將anti-miR-375與si-PIAS1共轉染AR42J細胞，Western印跡結果顯示anti-miR-375+si-PIAS1組PIAS1蛋白及細胞活性均顯著低于anti-miR-375+si-NC組(均P<0.05)，而P21蛋白顯著高于anti-miR-375+si-NC組(P<0.05)。見圖6、表6。表明抑制PIAS1表達可逆轉抑制miR-375對AR42J細胞增殖的促進作用。

1～4:anti-miR-NC組、anti-miR-375組、anti-miR-375+si-NC組、anti-miR-375+si-PIASI組；圖7同圖6 抑制PIAS1表達能逆轉抑制miR-375對CAE作用的AR42J細胞增殖相關蛋白的表達

2.6抑制PIAS1表達能逆轉抑制miR-375對CAE作用的AR42J細胞凋亡的抑制作用 流式細胞儀檢測共轉染anti-miR-375與si-PIAS1后AR42J細胞凋亡情況，結果顯示，與anti-miR-375+si-NC組比較，anti-miR-375+si-PIAS1組AR42J細胞凋亡率明顯升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)，而Bax蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)，見圖7、表7。表明抑制PIAS1表達可逆轉抑制miR-375對AR42J細胞凋亡的抑制作用。

圖7 抑制PIAS1表達能逆轉抑制miR-375對CAE作用的AR42J細胞凋亡蛋白的表達

表7 抑制PIAS1表達能逆轉抑制miR-375對CAE作用的AR42J細胞凋亡的抑制作用

3 討 論

AP發病機制涉及多層面、多階段及多基因等調控過程導致臨床尚無有效治療手段，研究過程中采用來自大鼠胰腺腺泡細胞瘤的AR42J細胞進行研究，相關報道指出AR42J細胞具有易培養、轉染效率高及CAE刺激反應大等優點〔9，10〕。因而本研究采用AR42J細胞構建AP模型。相關研究〔11〕表明miRNA表達異常與AP發生及發展密切相關。但miRNA與AP發生機制的內在聯系尚未完全闡明，因此本研究進一步探討miRNA與AP發生及發展的關系，以期進一步揭示AP發病機制。

miR-375表達水平升高可提高內質網氧化應激水平進而促使胰島β細胞凋亡導致2型糖尿病病情加重〔12〕。研究〔13，14〕表明miR-375是胰腺發育過程中特異性表達的miRNA分子之一，其表達水平與胰腺形態及功能維持密切相關，通過抑制miR-375表達可抑制糖尿病胰島β細胞凋亡進而達到治療糖尿病目的。李鴻翔等〔15〕研究表明miR-375可作為致病因素促進高血壓頸動脈斑塊陽性疾病發生及發展過程。抑制miR-375表達可通過調控PDK-1-AKT信號通路進而減弱心肌梗死后的炎癥反應及左心室功能障礙〔16〕。本研究結果說明miR-375可能在AP發生過程中發揮促進作用。進一步研究發現抑制miR-375后CAE作用的AR42J細胞增殖活性明顯增強，而細胞凋亡率明顯降低，并可明顯促進CyclinD1、Bcl-2表達，而抑制p21、Bax表達，其中CyclinD1可促進細胞周期進入S期進而調控細胞周期增殖，p21可抑制CyclinD1表達進而誘導細胞周期停滯于S期〔17〕。細胞凋亡是炎性反應等生理或病理條件下激活膜信號系統進而激活內源性DNA內切酶活性導致其自然死亡，而Bcl-2、Bax通常是調節細胞凋亡的主要因子，其中Bcl-2可抑制細胞凋亡，而Bax可促進細胞凋亡〔18〕。由此可知，抑制miR-375表達可通過調控細胞增殖及凋亡相關蛋白表達進而促進CAE作用的AR42J細胞增殖及抑制細胞凋亡。

PIAS1具有明顯抗炎作用，研究〔19〕表明PIAS1可通過抑制炎癥微環境下胃癌細胞發生的上皮-間質細胞轉化進程進而抑制腫瘤細胞遷移及侵襲。Janus激酶/信號轉導與轉錄激活子(STAT)信號轉導途徑激活與AP炎癥細胞過度激活密切相關，并可誘導AP促炎介質聚集進而加重AP疾病嚴重程度〔20〕。因而抑制JAK/STAT信號轉導途徑激活可有效控制AP炎癥反應。進一步研究表明PIAS1是JAK/STAT信號轉導途徑的負向調控因子，其可有效抑制其活化進程〔21，22〕。與上述研究結果相似，本研究結果表明CAE作用的AR42J細胞中PIAS1的表達水平明顯降低，AR42J細胞中miR-375與PIAS1呈負相關，由此推測miR-375是否為PIAS1的上游調控基因。通過靶基因預測軟件分析顯示miR-375與PIAS1存在結合位點，進一步采用雙熒光素酶報告基因實驗檢測證實PIAS1是miR-375的靶基因，同時通過qRT-PCR與Western印跡驗證miR-375與PIAS1的調控關系，結果表明miR-375可負性調控PIAS1的表達。為驗證miR-375是否可通過靶向調控PIAS1表達進而參與AP發生及發展過程，本研究提示抑制miR-375可通過上調PIAS1表達進而抑制CAE作用的AR42J細胞凋亡并促進細胞增殖進而減緩疾病進展。