PI3K/AKT信號通路與骨質疏松關系的研究進展

楊一秋 李蘭 趙娜 解繼勝 (右江民族醫學院,廣西 百色 533000)

骨質疏松(OP)是一種常見的骨骼疾病,以降低骨量,破壞骨微結構為特征,最終引起骨骼脆弱并增加骨折風險〔1〕。原發性和繼發性是常見的OP 分型。原發性OP 可分為三型,其中Ⅰ型又稱為絕經后OP,為高轉換型,更年期婦女常見。Ⅱ型又稱為老年性OP,為低轉換型〔2〕。所謂的高轉換型是指破骨細胞活性升高而成骨細胞活性未升高,最終使得溶骨效應增強。低轉換型是指破骨細胞活動正常,但成骨細胞成骨能力降低。破骨細胞起著溶骨作用,成骨細胞起著成骨作用,在正常機體中二者是動態平衡的,對于維持正常骨代謝至關重要。磷脂酰肌醇-3 激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信號通路廣泛參與細胞增殖、分化、存活、代謝等生理過程〔3〕。多項研究〔4～6〕表明PI3K/AKT 信號通路既可以調控成骨細胞又可以調控破骨細胞,對于維持骨組織的穩定發揮了重要作用。本文就PI3K/AKT 信號通路和OP 之間關系的研究進展進行綜述。

1 PI3K/AKT 信號通路

PI3K 是一種激酶,磷脂酰肌醇2 磷酸(PIP2)可以被PI3K 磷酸化為PIP3,3 磷酸肌醇依賴性蛋白激酶(PDK)1 和PDK2 可以輔助PI3K 磷酸化AKT 的蘇氨酸磷酸化位點(Thr308)和絲氨酸磷酸化位點(Ser473)從而激活AKT〔7〕。活化的AKT 通過磷酸化作用激活或抑制下游靶蛋白如叉頭轉錄因子(Fox)O、糖原合成激酶(GSK)3、B 淋巴細胞瘤-2 基因相關啟動子(BAD)、哺乳動物雷帕霉素鈀蛋白(mTOR)等調節細胞周期、分化、存活、生長等。PI3K 家族(PI3Ks)幾乎表達于所有哺乳動物,人類PI3Ks 根據其結構、調節模式、底物特異性可以被分為Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ3 類。Ⅰ類PI3Ks 研究最多,通過催化亞基和調節亞基來控制酶的活性。相應的刺激因子和G 蛋白耦聯受體、酪氨酸激酶受體、細胞因子受體、生長因子受體結合后可以激活PI3K 信號通路。Ⅱ類PI3Ks 只有催化亞基而無調節亞基,但其可以作為適配器分子出現在多種蛋白質互作中。Ⅲ類PI3Ks 目前只發現Vsp34 這一個成員,并且在所有真核細胞中都是保守的,主要參與調節空泡轉運和自噬〔8〕。

2 OP 與成骨細胞、破骨細胞的關系

破骨細胞的溶骨效應和成骨細胞的成骨能力在骨穩態維持過程中扮演重要角色。成骨細胞或破骨細胞譜系的多種細胞類型組成骨重塑單元。前者包括產生成骨細胞的間充質祖細胞,繼而產生骨襯細胞或骨細胞,而后者則包括成熟的破骨細胞及其巨噬細胞前體。骨重塑單元通過將骨吸收與骨形成耦合,協調兩種細胞譜系的分化和功能,在維持人骨骼平衡過程中發揮重要作用〔9〕。PI3K/AKT 信號通路在成骨細胞和破骨細胞的生長、分化等方面發揮作用,從而參與OP 的進程。

3 PI3K/AKT 信號通路與成骨細胞、破骨細胞的關系

3.1 PI3K/AKT 信號通路與成骨細胞 研究表明,PI3K/AKT 信號通路可以促進成骨細胞增殖、分化和骨形成從而達到抑制OP 的目的〔6〕。糖皮質激素(GC)是廣泛用于治療炎癥或自身免疫性疾病的藥物。地塞米松是一種人工合成的GC,通過下調p-PI3K 和p-AKT 的表達來抑制成骨細胞和MC3T3-E1 細胞中PI3K/AKT 信號通路的激活,使得糖原合成酶激酶(GSK)-3β 表達明顯上調,最終抑制了細胞的增殖并誘導其凋亡〔10〕。硅是人體必需的微量元素之一,缺乏會導致骨骼疾病。大量動物實驗表明,適當增加硅的攝入有助于增強骨密度和韌性,從而預防OP。研究發現原硅酸能夠增強PI3K、p-AKT、p-mTOR 及成骨相關標志物——Ⅰ型膠原蛋白的表達。在給予PI3K/AKT/mTOR 通路特異性抑制劑LY294002 之后PI3K、p-AKT、p-mTOR、Runt 相關轉錄因子(RUNX)2 表達下降,結果表明PI3K/AKT/mTOR 通路在原硅酸介導的體外成骨過程中發揮了積極的調節作用〔11〕。Chen 等〔12〕利用體外皮層切片及小鼠RAW264.7 細胞在巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)和核因子(NF)-κB 受體活化因子配體(RANKL)的誘導下形成破骨細胞從而建立骨吸收模型,然后用骨吸收上清液(BRS)培養成骨細胞前體細胞系MC3T3-E1,結果表明BRS 增強了MC3T3-E1 細胞中AKT 和p-AKT 的表達水平,促進了MC3T3-E1 細胞向成骨細胞分化及鈣化的面積。白細胞介素(IL)-37 是一種關鍵的抗炎細胞因子,在多種自身免疫性相關的骨科疾病(包括類風濕性關節炎、強直性脊柱炎和OP)中異常表達。研究發現IL-37 可以通過激活PI3K/AKT 信號通路途徑增加骨髓間充質干細胞(MSCs)中成骨細胞特異性基因的表達、礦物質沉積數量及堿性磷酸酶的活性,而PI3K/AKT 信號通路抑制劑可以部分逆轉由于IL-37 的存在而增強的MSC 的成骨分化〔13〕。

3.2 PI3K/AKT 信號通路與破骨細胞 破骨細胞是一種多核細胞,是骨組織內唯一具有骨吸收功能的細胞。由造血干細胞來源的單核巨噬細胞系在RANKL 和M-CSF 的作用下分化而來〔14〕。M-CSF 和破骨細胞前體細胞上的受體CSF-1R 結合通過激活相關酶如酪氨酸蛋白激酶(Src)、磷脂酶(PL)C-γ、PI3K、AKT 等促進了細胞的增殖和存活〔15〕。RANKL 干預后可以通過激活NF-κB 等多條信號通路從而刺激破骨細胞相關基因的表達,如活化T-細胞核因子(NFATc)1、人類破骨細胞相關受體(OSCAR)和抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)〔16〕。其中NFATc1 的表達對于破骨細胞生成至關重要,即使沒有RANKL 的刺激,NFATc1 在破骨細胞前體細胞中的異位表達也可以促進破骨細胞的生成〔17〕。此外,通過RANKL 刺激缺乏NFATc1 的胚胎干細胞并不能分化為破骨細胞,進一步表明NFATc1 對于破骨細胞的分化起著重要作用〔18〕。

當女性進入絕經期后,由于卵巢功能衰退,雌激素水平低于正常值,破骨細胞溶骨能力增強,導致骨溶解的速度明顯超過骨形成,骨量迅速減少,最終導致絕經后OP〔19〕。研究發現,絕經后OP 的發生與雌激素水平的下降和氧化應激(OS)水平的升高息息相關〔20〕。正常情況下通過消除氧自由基如活性氧(ROS)來抵抗氧化作用對機體造成的損傷,但當體內ROS 不斷累積時,將導致細胞膜、DNA 損傷,并加快破骨細胞形成,最終導致骨量降低、骨吸收增加〔21〕。ROS 對于調節細胞增殖、存活、代謝、凋亡、分化和遷移是必不可少的。ROS 對于機體具有雙重作用,當其充當細胞內信號傳導分子時,對機體是有益的,但是當其水平隨著年齡或炎癥狀態的發生而增加時,對機體是有害的〔22〕。研究發現OS 可以促進OP 進程,過量的ROS 可以抑制成骨細胞增殖,誘導成骨細胞凋亡,降低其活性,最終導致骨量降低〔23〕。同時ROS 水平的異常升高使得破骨細胞功能活躍,骨吸收效應增加。

FoxOS 屬于叉頭框蛋白家族中的一個亞類,其主要在細胞凋亡,DNA 損傷修復和ROS 清除過程中發揮作用〔24〕。Bartell 等〔15〕研究表明,M-CSF 和RANKL 通過激活PI3K/AKT 信號通路,抑制FoxO1的表達減少了抗過氧化物酶等的表達而使得破骨前體細胞中過氧化氫(H2O2)表達升高,進一步刺激破骨細胞的形成和骨吸收。而FoxO1 可以激活一些抗氧化酶基因的表達如:谷胱甘肽過氧化酶、H2O2酶和超氧化物歧化酶來抵抗H2O2對破骨細胞的促進作用,在OP 中發揮保護作用。白藜蘆醇(RES)是一種多酚植物雌激素,具有增強免疫力、抗炎、抗菌、抗氧化、抗腫瘤等多重功效〔25〕。馮燕陵〔26〕研究發現,RES、葛根素可以通過抑制PI3K/AKT 信號通路,上調FoxO1 蛋白的表達水平和轉錄水平通過促進抗氧化物基因的表達降低由OVX 誘導的RANKL的異常升高,上調OPG 的表達,進而抑制破骨細胞的生成、活性和骨吸收能力。脂多糖(LPS)是革蘭陰性菌細胞壁產物,可以刺激機體產生諸如腫瘤壞死因子(TNF)-α、IL-1β、前列腺素(PG)E2 等炎癥因子促進破骨細胞分化,在骨溶解性疾病中發揮重要作用,葛根素是葛根的主要活性成分,是一種植物雌激素,有雌激素樣活性,可以通過抑制AKT ser473、AKT thr308 位點的磷酸化活化從而抑制LPS 誘導的破骨細胞形成、功能和骨丟失〔27〕。

第10 號染色體缺失的磷酸酶(PTEN)和張力蛋白同源基因與SHIP 都是PI3K/AKT 信號通路的負性調節器,PTEN 是一種具有脂質磷酸酶和蛋白磷酸酶活性的抑癌基因,其N 端具有脂質磷酸酶活性可以使PIP3 脫磷酸,減少PIP3 的生成,從而達到抑制PI3K/AKT 信號通路的目的,并且進一步抑制細胞的生長并促進細胞死亡。其C 端具有不同的絲/蘇氨酸磷酸化位點(T366、S362、S370、S380、T382、T383、S385)可以被不同的激酶磷酸化,使其失去對PIP3 的去磷酸作用,導致PTEN 抑制PI3K/AKT 信號通路的功能失活〔28〕。PI3K 在RANKL 誘導的破骨細胞生成中發揮重要作用,意味著PTEN 也可以調節破骨細胞的功能。所以當RAW264.7 細胞過表達PTEN 時,下調了磷酸化的AKT、BAD、NF-κB抑制因子(IκB)a,同時也減低了NF-κB 的表達并導致RAW264.7 細胞凋亡增多,破骨細胞生成減少〔29〕。SHIP 是一種Src 同源2-肌醇-5 磷酸酶,廣泛表達于造血細胞,可以水解PIP3 的5 位磷酸,負性調節PI3K/AKT 信號通路〔30〕。研究表明在SHIP 敲除的小鼠體內,通過激活AKT/GSK-3β/NFATc1 信號通路,促進NFATc1 的核定位,使得破骨細胞生成增多〔31〕。梓醇通過抑制Iκb、AKT、GSK3β 的磷酸化及P65 的磷酸化和核轉位以劑量依賴性的方式抑制RANKL 誘導的破骨細胞生成過程中NFATc1、c-fos、ctsk、trap 蛋白的表達,然而絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族中細胞外調節蛋白激酶(ERK)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)、p38 蛋白的磷酸化水平并不會被梓醇影響。RANKL 可以使磷酸化的PTEN 蛋白下降,但不會改變總PTEN 的蛋白水平,而梓醇干預后可以逆轉磷酸化PTEN 蛋白的下降趨勢,同時上調總PTEN 的蛋白表達水平。進一步研究發現,梓醇通過抑制PTEN 的泛素化降解上調PTEN 蛋白的活性,從而導致破骨細胞生成減少〔32〕。在RANKL 誘導的破骨細胞分化過程中,由于GSK-3β功能的鈍化使得磷酸化的PTEN 逐漸減少,最終導致PTEN 對PI3K/AKT 信號通路的抑制作用也減少,提示PTEN 磷酸化水平越低越有利于破骨細胞的分化〔33〕。

GSK-3 是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶,可以被AKT激酶磷酸化失活。最初是研究其在糖原沉積中的調節作用,被認為是糖原代謝的關鍵酶〔34〕。GSK-3 有GSK-3α 和GSK-3β 兩種亞型。其參與許多生物學進程,如新陳代謝、轉錄、翻譯、細胞生長及細胞凋亡等〔35〕。GSK-3 可以調節多種轉錄因子,包括周期蛋白(cyclin)D1、c-Jun、NFATc 及β-catenin。GSK-3α的絲氨酸殘基ser-21 和GSK-3β 的絲氨酸殘基ser-9可以被多種激酶通過磷酸化途徑抑制,進而抑制了GSK-3 的活性。GSK-3 絲氨酸磷酸化抑制了GSK-3磷酸化底物的能力〔36〕。GSK-3β 可以磷酸化NFATc1 從而調節NFATc1 的亞細胞定位,進一步在破骨細胞分化中發揮作用〔37〕。研究表明,GSK-3β通過調節NFATc1 的表達,來抑制破骨細胞的生成。同時發現RNAKL 刺激破骨細胞前體產生破骨細胞的過程中,GSK-3β 的ser-9 被磷酸化使得GSK-3β活性被抑制。GSK-3β 活性持續表達的GSK-3β-S9A轉基因小鼠體內,NFATc1 和破骨細胞生成基因表達受損,使得小鼠出現嚴重的骨硬化表型〔35〕。也就是說GSK-3β 是RANKL 誘導的破骨細胞生成過程中的負性調節物。

綜上,OP 是一種與年齡密切相關的骨骼疾病。最嚴重的后果是骨折,常見部位是:椎體、髖部、前臂遠端、肱骨近端和骨盆等。OP 性骨折危害巨大,給老年患者的生活帶來巨大痛苦并且對于家庭和社會來說也是一個沉重的負擔。臨床現有的治療方法有一定的局限性,并且存在一些不良反應。如雙磷酸鹽是目前臨床上應用最為廣泛的抗OP 藥物,與骨骼羥磷灰石有較高的親和力,能夠結合到骨重建活躍的骨表面,抑制破骨細胞骨吸收功能從而抑制骨破壞。但依然存在一些問題,包括胃腸道不良反應、一過性“流感樣”癥狀、腎臟毒性及下頜骨壞死等〔38〕。降鈣素類藥物,如鰻魚降鈣素類似物和鮭降鈣素,總體來看藥物安全性較好,但少數患者使用后出現面部潮紅、惡心、過敏等不良反應。雌激素治療法能減少骨丟失,降低OP 骨折發生率,但增加了患子宮內膜癌、乳腺癌、心血管疾病等的風險。PI3K/AKT 信號通路是OP 發病機制中重要組成部分,從分子角度提出了一種新的OP 治療方案及相關治療靶點,對于新藥研發有積極的促進作用。