農產品因輻照滅菌效果快速測試中對于ATP生物發光技術的應用

李奎 蔚江濤 牛偉 白俊青 李世超

（1.楊凌核盛輻照技術有限公司 陜西西安 710100；2.中陜核核盛科技有限公司 陜西西安 710100）

我國農產品輻照研究工作與輻照滅菌技術的應用開始于20 世紀50 年代末，經過半個多世紀的發展，國內農產品的輻照設備、輻照技術、輻照應用范圍相對擴大。尤其在網絡購物方式興起后刺激了農產品需求、提升了消費者對農產品的品質要求。在這種情況下，需要進一步增強農產品輻照滅菌效果快速測試，實現對其危害與關鍵點的控制。下面先對ATP生物發光技術作出說明，再對其應用展開分析。

1 ATP生物發光技術

ATP中文名為腺苷三磷酸，分子簡式為A-P～P～P，主要由腺嘌呤、核糖、磷酸基團（3 個）共同構成，作為一種高能磷酸化合物發揮作用。ATP的生成途徑包括光反應、細胞呼吸等。在細菌中ATP 含量與細菌量呈正相關關系，細菌死亡后ATP 會迅速發生酶降解現象或者擴散現象。當細菌量增大量，細菌內的ATP 含量相對增大，反之則減小。細菌在輻照死亡后，ATP會擴散出去。因此，在該特征下，結合生物發光（主要是生命活性生物體產生的化學發光現象，如螢火蟲等）逐漸形成了可資利用的ATP 生物發光技術。簡單講，就是通過化學發光現象，對ATP進行測定，以此確定測定對象中的細菌量［1］。

例如，在常見的農產品脫水蔬菜中，大腸桿菌十分常見。按照我國企業產品質量衛生標準規范看，脫水蔬菜中菌落總數需要控制在每克不大于10000 個，其中的大腸桿菌MPN 應控制在30 個/100g 的范圍內［2］。根據現階段的研究成果看，普通細菌中應用的輻照劑量往往高于大腸桿菌死亡所需的輻照劑量，因此，在這種情況下，可以針對脫水蔬菜中的細菌ATP，采用ATP生物發光技術進行處理，提高輻照滅菌效果與測試速度。從實踐經驗看，從2005 年開始，我國在各級衛生監督機構中已經配置了ATP 發光檢測設備，目前對其應用效率與效用均有所提升。

2 ATP生物發光技術的具體應用分析

2.1 材料與方法

2.1.1 材料

以某食品企業生產制造的調味品為準，本次研究中選擇的供試材料包括辣椒粉、胡椒粉、脫水蔬菜。試劑以采購方式為準，購于中國科學院某植物生理研究所，具體的試劑包括ATP標樣、熒光素、熒光素酶。

2.1.2 輻照處理

首先，將劑量率設置為50Gy/min。其次，在該標準下設置不同劑量，本次研究中設置的劑量共計5個，分別為0kGy、3.0kGy、6.0kGy、9.0kGy、12.0kGy，按照每個劑量處理3次的方式進行操作。

2.1.3 ATP提取步驟

第一，分別稱取0.5g 辣椒粉、胡椒粉、脫水蔬菜樣品，按照1∶10（m/v）、1∶10（m/v）、1∶20（m/v）的比例混入Tris-EDTA 進行混合，制成漿液。本次實驗中選擇的Tris-EDTA 中，Tris 為20mmol/L、EDTA 為2mmol/L，酸堿度為7.75。第二，在沸水浴中，設置90s煮混合漿液，待其煮沸后即刻進行冷卻處理。第三，在離心機中按照3000r/min的速度對其進行離心處理，共計3min。第四，將離心后的混合漿液中的上清液取出用于ATP 待測液。需要說明的是在ATP 發光強度方面，細菌ATP大于非細菌，因此可以活力非細菌ATP清除步驟。

2.1.4 ATP測定步驟

首先，取ATP 待測液200ul 放入反應杯，然后將反應杯放入SHG-D生物化學發光儀中。其次，取熒光素酶-熒光素混合液800μL 注入反應杯，蓋好蓋子后，將發光儀上的溫度設置為25℃、時間設置為10s，測定ATP 溶液發光值。在發光強度表示方面，嚴格按照相對發光單位RLU，將積分值設置在10s以內。

2.2 結果與分析

2.2.1 待輻照農產品含菌量測定

首先，對待輻照農產品樣品中的非細菌ATP 發光強度與ATP發光強度進行比較分析，前者小于后者，節省了對非細菌ATP 清除環節。同時，細菌ATP 提取時間共花去90s，其中存在最大發光強度。另外，在回收率方面進行總結，3種樣品的回收率均在95%以上，試驗時間范圍在1～2h。因此，滿足常規ATP 提取要求。其次，將試驗材料分為6份，每個樣品均為2份：1份進行高壓滅菌、1份不滅菌。將2份樣品混合后配置含菌樣品，測定細菌ATP生物發光與細菌總數，建立坐標系獲得3種樣品的回歸方程：（1）Y辣椒粉=0.1953X+2.1962；（2）Y胡椒粉=0.3202X+2.4468；（3）Y香蔥粉=1.4367X-3.2850。統計分析結果顯示，r值分別為0.99、0.98、0.98，均大于0.96（r0.01值）。由此可知，細菌總數與細菌ATP 發光強度之間存在相關性。由于溶液顏色對于ATP發光強度的影響表現為“色素濃度增大，影響隨之增大”，由此也導致了回歸方程對應曲線斜率方面的差異。

2.2.2 輻照農產品含菌量測定

第一，在0kGy、3.0kGy、6.0kGy、9.0kGy、12.0kGy 劑量下，對輻照樣品進行ATP發光強度數據統計，結果顯示，在不同的劑量下，輻照樣品中細菌ATP提取液發光強度隨著劑量的增大而增加，發光強度呈現為先高后低的趨勢，詳見表1。根據ATP 生物發光技術的基本應用原理看，輻照后的農產品中的活菌數是先增后減，結合實踐經驗看，在壓力蒸汽滅菌條件下，農產品含菌量與細菌ATP發光強度之間存在一定的線性關聯。在輻照條件下，ATP 二者具有相關性。區別僅在于輻照滅菌處理條件下，會對樣品檢測過程產生相應的影響，而且這種影響可以持續50d 左右，時效性相對較好［3］。

表1 不同輻照劑量下的脫水蔬菜發光強度與細菌總數

第二，從動力學角度分析細菌ATP生物發光過程，發現將熒光素酶-熒光素加入到細菌ATP 提取液后不久（較短時間內），ATP發光值達到最高點，滿足動力學方程。具體分析中主要是采用直線化處理辦法，將動力學方程處理為直線方程，然后對其發光曲線動態變化情況進行測定分析，進而反映出發光過程受到的影響程度。操作如下：（1）對A=A0e-Kt（k 為常數）進行直線化處理，得 到InA=InA0-kt。（2）假定Y=InA，Y0=InA0，得到Y=Y0-kt。（3）假定測量時間間隔為4s，可以對其進行連續性測定，詳見表2。結果顯示處理后的樣品內細菌ATP發光強度衰減速度快。既符合ATP生物發光技術的原理，也與本次實驗測定結果趨于一致。根據數值統計結果看，當輻照劑量為5.0kGy 時達到了最大值，之后處于降低趨勢。

表2 農產品輻照條件下對細菌ATP 生物發光影響

第三，輻照處理產生的影響情況看，在應用ATP生物發光技術時主要是依賴于添加的熒光素酶-熒光素。從特征看，該物質具有較高的特異性與靈敏度，當其加入到ATP 提取液之后，ATP 的濃度也隨發光強度的變化而變化［4］。由于本次研究中采用的輻照以γ射線為主，所以在輻照條件下對其發光強度變化與ATP 濃度之間的關系可以通過γ射線做進一步分析。用紫外分光光度計對樣品中ATP 含量檢測時，當紫外線波長為260nm，ATP 在吸收紫外線方面對其具有較好的吸收性，同時當吸光值增大時，也表明其中的ATP 含量較大，由此可知其中的含菌量較大。反之，當吸光值變小時，則會出現活菌量較小的現象。因此從關系方面看，紫外線與樣品ATP含量呈現為負相關關聯。在電離輻射時選擇γ射線，統計相關數據結果顯示劑量增大時，其中的ATP含量因吸收了γ射線而相應減少。因此在輻照條件下，ATP含量不會增大，反而會因輻照時間的延長、輻照被吸收量的增大而減少。

第四，從干擾方面分析，待輻照樣品含菌在輻照條件下主要受到γ 射線影響，因此在整個過程中可能會產生一定的干擾。為了進一步驗證其受干擾情況，本次研究中，對存放了半年的γ 射線輻照產品進行了拆包檢驗（即對本次研究3 種樣品一樣、保質時間在180d 后的產品進行了1∶1 比例的滅菌分析），結果顯示：3 種樣品與拆包檢驗的產品之間均無明顯差異。由此可見，γ 射線對于輻照過程的ATP 生物發光不存在干擾［5］。

為了查找可能的干擾源，經查閱讀資料與交流經驗后，認為對于細菌ATP 提取液發光值產生干擾的因素，可能來自輻照后的細菌所致。因此，以3種樣品為準，先用生理鹽水（5%）對樣品進行未滅菌之前的洗脫處理，然后將其放置在培養箱中（溫度設置為25℃）靜置3d再對其進行輻照處理，經對樣品細菌ATP提取液進行測定分析發現，ATP 提取液中的發光值存在異常［6］。另外，考慮到加入熒光素酶-熒光素反應液后出現了干擾現象，所以對加入反應液與未加入反應液的樣品細菌ATP 提取液進行了對比分析，雖然沒有獲得明顯證據，但是并不能排除直接購買的反應液中存在某些脫酸激酶存在。因此，在后續的研究中，仍然需要對直接購置的反應液進行專業研究與實驗分析，搞清楚在應用ATP生物發光技術時潛在的干擾源等。

3 結語

綜上所述，農產品生長于土壤環境，攜帶著各種細菌，食用后會對人體產生一定的危害。因此，在現代農產品生產制造、加工儲存中，普遍應用了輻照滅菌技術保障其安全。為了有效達到對此類技術的應用效用，在常用的輻照滅菌技術方面，可以結合ATP 生物發光技術開展微生物檢驗，提高農產品輻照滅菌效果的快速測試效率，從而保障輻照滅菌技術的應用效用。結合以上初步分析可以看出，輻照農產品樣品測定中細菌總數與細菌ATP 發光強度之間存在相關性，輻照滅菌處理條件下，ATP 生物發光技術會對樣品檢測過程產生相應的影響，造成這種影響的因素可能來自反應液質量與滅菌后的細菌感染。因此，應該對其開展進一步研究。