黃精發酵體系中植物乳桿菌的分離鑒定和MTT法活菌快速檢測研究

金劍 勞嘉 鐘燦 肖文廣 曾宏亮 胡國安 賀煒 張水寒

〔摘要〕 目的 從黃精發酵體系中分離鑒定益生菌，并建立其快速檢測方法。方法 通過形態學觀察、革蘭氏染色、16S rRNA基因序列測定和同源性分析對分離的菌株進行鑒定，采用MTT法建立快速檢測方法。結果 從鮮黃精發酵體系中分離獲得一株乳酸菌，鑒定為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）;建立了植物乳桿菌檢測的MTT法，發現檢測最佳波長為545 nm，適宜染色時間為2 h，最低檢測度為活菌濃度為107 CFU/mL，在活菌濃度為7×107～3×108 CFU/mL范圍內，植物乳桿菌樣品活菌濃度與545 nm處OD呈現良好的線性關系。結論 從黃精發酵體系中分離純化了一株植物乳桿菌，可以通過MTT法快速檢測其活菌總數，為益生菌活菌快速檢測提供了參考。

〔關鍵詞〕 黃精;益生菌;植物乳桿菌;MTT法;快速檢測

〔中圖分類號〕R283? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2022.02.013

Isolation and identification of lactic acid bacteria from fermented broth of

polygonatum and fast detection of live bacteria by MTT method

JIN Jian1， LAO Jia2， ZHONG Can1， XIAO Wenguang3， ZENG Hongliang1， HU Guoan2， HE Wei2*， ZHANG Shuihan1

（1. Institute of Chinese Materia Medica， Hunan Academy of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410013， China;

2. Resgreen Group International Inc.， Changsha， Hunan 410329， China;

3. Hunan Traditional Chinese Medical College， Zhuzhou， Hunan 412008， China）

〔Abstract〕 Objective To isolate and identify probiotics from the fermented broth of polygonatum， and to establish a rapid detection method. Methods The isolated strains were identified by morphological observation， Gram staining， 16S rRNA gene sequence determination and homology analysis， and the rapid detection method was established by MTT method. Results A strain of lactic acid bacteria was isolated from the fresh polygonatum fermentation broth and was identified as Lactobacillus plantarum. MTT method for the detection of Lactobacillus plantarum was established. The study found that the best wavelength was 545 nm， the suitable staining time was 2 h， and the minimum detection of the concentration of live bacteria was 107 CFU/mL. In the range of the concentration of live bacteria from 7×107 CFU/mL to 3×108 CFU/mL， live bacteria concentration of the Lactobacillus plantarum and the OD at 545 nm showed a good linear relationship. Conclusion A strain of Lactobacillus plantarum was isolated and purified from the fermented broth of polygonatum. The total number of live bacteria can be quickly detected by the MTT method， which provides a reference for the rapid detection of probiotics.

〔Keywords〕 polygonatum; probiotics; Lactobacillus plantarum; MTT method; rapid detection

黃精是我國傳統的大宗藥食兩用資源，其具有抗氧化、降血糖、抗疲勞、提高免疫等多種藥理作用[1]。作為藥食兩用資源，雖然近年來有黃精酸奶[2]、黃精山楂酸奶[3]等產品報道，但總體而言黃精的產品形式較為單一，傳統黃精的主要產品形式是蒸制之后的黃精飲片[4-5]。酵素作為新型的產品形式越來越受到消費者的青睞，而黃精通過發酵技術不僅可以改善口感，還可拓寬中藥資源黃精的產品范圍[6]。通過發酵生產食用酵素成為藥食同源產業研究的一個新熱點[7]。例如人參酵素[8]、鐵皮石斛酵素[9]和歸芪參草功能酵素[10]等，都已開展了相關研究。楊婧娟等[6]進行了黃精發酵工藝的初步研究。陳安徽等[11]分析了黃精酵素口服液中鈣、鐵和鋅的形態。胡佳麗等[12]關注了黃精發酵過程中洛伐他汀、皂苷等含量與色澤的相關性。鐘燦等[13]對黃精發酵體系酶活力變化進行了報道，分析了黃精發酵過程中甜度、pH值、抗氧化活性、蛋白酶、淀粉酶和纖維素酶活性的動態變化，為黃精酵素的工藝優化和產品研發提供了數據支撐，促進了黃精發酵的產業化發展。

發酵體系中一個關鍵的因素是微生物，以益生菌為主。研究藥食同源發酵，離不開對益生菌的分離、鑒定和活力檢測。隨著細胞生物學的不斷發展，微生物計數在科研和生產中得到廣泛的應用。目前，通過平板稀釋計數法檢測活菌總數應用廣泛，但操作復雜、耗時長、準確度偏低且易受環境雜菌污染，有必要建立一種操作簡單、快速、準確并可反映細菌活性的細菌計數方法。近年來發現，噻唑藍[3-（4，5）-dimethylthiahiazo（-z-y1）-3， 5-di-phenytetrazoliumromide， MTT]法具有簡單、快速、靈敏、穩定等特點，已開始應用于益生菌活菌數快速檢測研究[14-15]。MTT法能夠快速測定益生菌活菌數目，但其精確度與細菌種類、生長狀態及其代謝產物有關[16]。目前，在黃精發酵體系中暫未有相關研究報道。本研究在黃精發酵體系中，通過分離純化和鑒定篩選出了一株植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），建立了MTT快速檢測方法，對益生菌發酵體系的研究提供基礎。

1 材料與方法

1.1? 實驗材料

MTT（上海源葉生物科技有限公司，批號：Y11M11k109515）;鮮黃精購自新化縣頤樸源黃精科技有限公司，經湖南省中醫藥研究院劉浩副研究員鑒定為多花黃精（Polygonatum cyrtonema Hua），系《中華人民共和國藥典》一部[17]所收載的品種。

1.2? 實驗設備

紫外可見分光光度計（上海佑科儀器儀表有限公司，型號：UV755B）;振蕩器（海門市麒麟醫用儀器廠，型號：Vortex-5）;立式高壓蒸鍋（上海申安醫療器械廠，型號：LDZX-75KRBS）;潔凈工作臺（蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司，型號：SW-CJ-1FD）;臺式高速冷凍離心機（賽默飛世爾科技有限公司，型號：Multifuge X1R）;顯微鏡（日本東京Olympus公司，型號：Olympus CX31）;聚合酶鏈式反應擴增儀（德國漢堡Eppendorf公司，型號：Eppendorf AG）。

1.3? 實驗方法

1.3.1? 改良的MRS培養基? 蛋白胨10 g/L，酵母浸粉10 g/L，葡萄糖20 g/L，檸檬酸三銨2 g/L，三水乙酸鈉5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，MnSO4 0.2 g/L，吐溫80 0.5 g/L，CaCO3 20 g/L，瓊脂15 g/L。調節pH至6.2，分裝后121 ℃高壓滅菌20 min。

1.3.2? PBS溶液配制[15]? 用于溶解MTT的PBS-1溶液：取NaCl 4.0 g、K2HPO4 0.575 g、KH2PO4 0.1 g，ddH2O定容至500 mL，超聲5 min使其溶解完全，調節pH為7.2，121 ℃滅菌15 min，室溫保存。用于稀釋菌液樣品的PBS-2溶液：取NaCl 4.25 g、KCl 0.1 g、Na2HPO4 1.425 g、KH2PO4 0.135 g，ddH2O定容至500 mL，超聲溶解，調節pH至7.0，121 ℃滅菌15 min，室溫保存。

1.3.3? 乳酸菌的分離和形態觀察? 黃精發酵方法參照前期報道[18]，取不同發酵時期的發酵液采用10倍稀釋法，分別取0.1 mL稀釋液涂布于培養基上，37 ℃恒溫培養 2～3 d，觀察菌落形態。挑選具有明顯菌落形態、溶鈣圈較大的單菌落，在MRS平板上重復劃線分離菌株，以純化單菌落。對純化的單菌落進行革蘭氏染色觀察[19]。

1.3.4? 菌種鑒定? 采用16S rRNA法對分離的單菌落進行鑒定，利用DNA快速提取試劑盒提取DNA，選擇通用引物27F/1492R進行PCR擴增，其中1492R：5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’，27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，將PCR產物送長沙擎科生物技術有限公司測序，序列結果在美國國家生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information， NCBI）進行BLAST比對，下載同源性較高的序列，采用MEGA軟件鄰接法構建系統發育樹分析[20]。

1.3.5? 微生物平板計數? 發酵體系中的益生菌活菌數量統計參照平板計數法[15]進行，于37 ℃培養箱培養24 h后，進行平板菌落計數，統計樣品中的活菌總數。通過平板計數，確定不同樣品中的活菌總數。

1.3.6? MTT法檢測? MTT采用PBS-1溶液溶解配制，具體染色檢測操作參考文獻方法[15]。取稀釋好的菌液4.5 mL于10 mL離心管，并在10 000 r/min條件下離心10 min（離心半徑160 mm）后去其上清液，在超凈工作臺里加入4.5 mL PBS-2溶液、0.4 mL MTT染色劑后，混勻，37 ℃染色反應后，10 000 r/min離心5 min（離心半徑160 mm），分離出離心沉淀甲臜后，加入4 mL DMSO，10 000 r/min離心5 min（離心半徑160 mm），在紫外可見分光光度計下測定其吸光值（optical density， OD）。

1.3.7? MTT法條件優化? （1）最佳吸收波長確定：采用MTT法得到的反應液進行400～700 nm掃描，取間隔范圍為5 nm，觀察最大吸收峰。（2）MTT染色時間確定：通過觀察MTT與菌液反應顏色的變化，分別設定4個反應時間，即0、30、60、120、240 min，在最大吸收波長545 nm處測定吸光度。（3）MTT可測量范圍確定：將菌液按照10倍稀釋法稀釋至不同濃度，MTT染色反應2 h后，在波長545 nm處測定OD。（4）MTT法標準曲線繪制：將菌液稀釋至109 CFU/mL后再細化稀釋到不同濃度，MTT染色反應2 h后，在波長545 nm處測定OD，同時通過平板計數法計算樣品中的活菌數，以活菌數為橫坐標、OD為縱坐標進行線性關系分析。

2 結果

2.1? 乳酸菌的分離鑒定

從鮮黃精發酵體系中，用MRS培養基分離純化微生物。其菌落表觀性狀基本一致，直徑約3～5 mm，凸起，呈圓形，表面光滑，細密，色白（圖1A），在MRS培養基中能夠產生溶鈣圈（圖1B）。進一步在顯微鏡下觀察發現，該微生物為圓端直桿菌，長度為1～4 μm，單個、成對或短鏈狀，缺乏鞭毛，但能運動，革蘭氏染色呈現藍紫色，可以判斷分離菌株為革蘭氏陽性桿菌（圖1C）。

2.2? 植物乳桿菌鑒定

通過16S rRNA序列擴增，測序，序列長度為1439 bp，基因測序結果已上傳GenBank數據庫并收錄，收錄信息為SUB5941108 Lactobacillus MN165453。在NCBI進行Blast基因序列比對，與多條植物乳桿菌的序列匹配達到100%。進一步下載相關植物乳桿菌菌株序列和其他菌序列，包括干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）、德氏乳桿菌（Lactobacillus delbrueckii）、嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）和雙歧桿菌（Bifidobacterium bifidum），構建系統發育樹進行分析（圖2）。結合顯微觀察和形態學分析，從圖2可以進一步確定分離獲得的微生物為植物乳桿菌，將該菌株命名為HACM-LP001。

2.3? MTT法檢測波長和染色時間分析

分別在30、60、240 min，對加入MMT后的植物乳桿菌溶液進行400～750 nm全波長掃描，測量結果如圖3A所示。不同時間段，波長掃描圖呈現相同的變化趨勢，從400 nm開始，吸光度逐漸上升，在500～580 nm呈現最大吸收曲線，最大吸收波長為545 nm。從而，選取545 nm作為MTT與植物乳桿菌顯色反應后的最大吸收波長，設置0、30、60、120、240 min，開展不同反應時間的顯色程度實驗。從圖3B可見，不同反應時間OD也不同，且隨著時間的推移OD逐漸增大，在120 min曲線開始趨于平穩，表明反應120 min后，活菌與MTT染色液已充分反應。

2.4? MTT法靈敏度與活菌線性關系分析

將植物乳桿菌采用10倍稀釋法稀釋至不同濃度，通過平板計數法確定樣品中活菌的菌落數，同時采用MTT法對含有不同活菌數的樣品染色反應120 min，在545 nm處檢測該方法的靈敏性。由圖4A可知，當樣品中平板計數法統計的活菌濃度在109 CFU/mL時，MTT法檢測顯示的OD最大，隨著稀釋倍數的增大，OD呈遞減狀態，當平板計數法統計的活菌濃度在小于107 CFU/mL時，MTT法檢測顯示的OD趨于0。植物乳桿菌樣品中濃度在108 CFU/mL時，OD在0.2～0.8之間，是較為合適的測量范圍。進一步將植物乳桿菌樣品中活菌濃度在108 CFU/mL區間段進行細分，檢測MTT法顯色與平板計數法活菌總數的線性關系，結果如圖4B所示。在平板計數法統計的活菌濃度為7×107～3.1×108 CFU/mL范圍內，OD（545 nm）和植物乳桿菌樣品活菌濃度呈現良好的線性關系，相關系數R2為0.992，從而可以通過MTT法快速檢測植物乳桿菌樣品活菌菌落總數。

3 討論

藥食同源藥材發酵技術的研究是中藥領域的一個熱點。從藥食同源發酵體系中分離鑒定益生菌，并對發酵體系中益生菌活菌數量統計至關重要。但傳統的平板計數法過程復雜、耗時長，不能及時反應菌體生長情況[16]。因此，有必要在發酵體系中建立一種簡單、快速、靈敏的檢測方法。

雖然已有一些黃精發酵的研究，但從黃精發酵體系中分離鑒定益生菌鮮有報道。本研究從黃精發酵體系中分離獲得了一株乳桿菌，通過革蘭氏染色、基因序列測定及同源性分析，確定為植物乳桿菌（HACM-LP001）。植物乳桿菌是一種益生菌，具有多種保健作用，如調節免疫、維持腸道內菌群平衡、抑制致病菌，降低血清膽固醇含量和預防心血管疾病等[21]。基于MTT法發現，HACM-LP001植物乳桿菌在545 nm處有最大吸收峰，染色2 h，菌體濃度在108 CFU/mL左右時，具有良好的線性關系，表明該方法可以用于植物乳桿菌活菌數量的快速檢測。

MTT法具有簡單、快速、靈敏、穩定等特點，近年來逐漸用于生物細胞的活性檢測。其原理是水溶性的MTT染色劑可以與活細胞中的脫氫酶反應，還原成水不溶性的藍紫色結晶甲瓚并沉積在細胞中。由于死細胞不具備這一反應，因此用DMSO溶解所生成的甲瓚，通過檢測光密度值變化，可間接反映細胞生長及增殖活性[14]。MTT法在益生菌快速檢測中已開展相關研究，楊培潔等[14]采用MTT法開展了瑞士乳桿菌的檢測條件優化。李娜等[16]研究了保加利亞乳桿菌、濕熱乳酸鏈球菌的MTT法快速檢測。黃利坤等[15]基于MTT法對保加利亞乳桿菌和濕熱鏈球菌進行了測定。MTT法能夠快速測定益生菌活菌數目，然而已有研究發現，其精確度與細菌種類、生長狀態及其代謝產物有關[16]。不同益生菌的MTT法略存在差異，例如：瑞士乳桿菌的最佳波長是510 nm[14]，染色1 h即可檢測[15];保加利亞乳桿菌和濕熱鏈球菌的最大吸收波長是570 nm，其染色時間分別為1.5 h和2 h[15];而本研究通過全波長掃描植物乳桿菌MTT染色后樣品，發現在500～580 nm之間都呈現較大吸收特征，在545 nm處有最大吸收峰，染色時間為2 h。隨著染色時間延長，MTT反應更加充分，植物乳桿菌在染色2 h后效果穩定。考慮到方法的靈敏度，待測菌液的濃度需要調整到適宜的范圍，從而減小系統誤差。

綜上所述，本研究是首次從黃精發酵體系中分離純化發酵乳酸菌，經顯微和分子鑒定為植物乳桿菌，基于MTT染色建立了植物乳桿菌的快速檢測方法，為益生菌活菌快速檢測提供了參考。

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