2種頭孢氨芐片在比格犬體內的藥代動力學及生物等效性試驗

楊宇欣，趙富華，劉 羽，邱基程，曹玉穎，張 璐，白如念，王建中，曹興元

(1.中國農業大學動物醫學院,北京 100193；2.國家獸藥殘留基準實驗室，北京 100193；3.中國獸醫藥品監察所，北京 100081；4.北京市動物疫病預防控制中心，北京 100013；5.山西農業大學動物醫學學院，太谷 030801)

頭孢氨芐(cephalexin，CFX)是一種β-內酰胺類抗生素，屬于第一代頭孢菌素，用于治療多種感染[1]，具有成本低、抗菌譜廣和不良反應少等優點[2],其抗菌作用強于第二、三代頭孢菌素[3]。頭孢菌素的抗菌作用機理主要是其能抑制肽聚糖合成進而干擾細菌細胞膜合成[4]。從細菌生長期方面進行研究，頭孢菌素屬于繁殖期殺菌劑，能特異性地殺滅有細胞壁的細菌，且對人體和畜禽的影響較小[5]。頭孢氨芐對大多數革蘭氏陽性菌和厭氧菌具有較高抗菌活性，如對溶血性鏈球菌、金黃色葡萄球菌、奇異變形桿菌、肺炎鏈球菌、肺炎克雷伯菌、流感嗜血桿菌等都有抗菌作用[6]。人用頭孢氨芐主要用于呼吸道、尿路及皮膚軟組織感染的治療[7-8]，獸用制劑有相似的藥效。研究表明，頭孢氨芐可有效治療犬的細菌性感染，如皮膚感染(膿皮癥)[9]，此外，對由細菌引起的尿路、呼吸道、軟組織感染具有同樣的抗菌效果[10-11]。Bataineh等[12]研究2批頭孢氨芐膠囊在健康志愿者體內的藥代動力學和生物等效性發現,2批膠囊在藥代動力學上有顯著差異，不可相互替代；Yin等[13]對頭孢氨芐胃漂浮片進行體內外評價，結果表明胃漂浮片可延長藥物在主要吸收部位的停留時間，從而提高生物利用度；Prados等[14]研究頭孢氨芐懸浮液在犬體內的藥代動力學發現，該懸浮液在早上和晚上10：00飼喂所得的藥代動力學差異較小，并建議給藥間隔為12 h。目前，對頭孢氨芐膠囊、懸浮液等劑型的報道相對較多，而對頭孢氨芐片的藥代動力學報道較少，但頭孢氨芐片具有易飼喂、吸收迅速且生物利用度高等優點[15]，關于頭孢氨芐的藥代動力學研究主要采用高效液相色譜(HPLC)和液相色譜串聯質譜(LC-MS/MS)方法[16-20]，HPLC流動相一般較復雜，其色譜柱長度比超高效液相色譜串聯質譜(UPLC-MS/MS)的長，導致同一樣品消耗時間更長，UPLC-MS/MS具有檢測時間短、精度高、分離度好等優點。本試驗旨在建立頭孢氨芐的UPLC-MS/MS方法，獲得藥代動力學參數，以研究中國生產的受試制劑頭孢氨芐片(Trolevis?300)和法國生產的參比制劑(Rilexine?300)對比格犬口服給藥后的生物等效性，探討2種制劑是否具有相似的作用，在臨床上是否可相互替代。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品與試劑 受試制劑：Trolevis?300頭孢氨芐片購自上海漢維生物醫藥科技有限公司，300 mg/片；參比制劑：Rilexine?300頭孢氨芐片購自維克公司，300 mg/片；標準品：頭孢氨芐標準品購自中國獸醫藥品監察所，純度≥94.4%；乙腈、甲醇、甲酸均為質譜純，均購自賽默飛世爾科技有限公司；超純水由Milli-Q超純水儀制備，符合GB/T6682一級用水規定。

1.1.2 主要儀器 超高效液相色譜-串聯質譜儀(配電噴霧離子源)、色譜柱(BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm))均購自Waters公司；分析天平(ES225SM-DR，感量0.00001 g)購自Precisa公司；天平(BS2202S,感量0.01 g)購自Sartorius公司；高速冷凍離心機(Hettich，MIKRO22R)；渦旋混合器(HQ-60-Ⅱ)購自北京北方同正生物技術發展有限公司。

1.1.3 試驗動物 22只健康成年比格犬(1～2歲)，雌雄各半，體重為9.0～11.0 kg，購自北京遠大星火醫藥科技有限公司。研究開始前，所有程序都經過中國農業大學機構動物護理和使用委員會的審查和批準(63303-19-E-001)。

1.2 給藥方案及血樣采集

試驗開始前，將犬在試驗犬籠中適應性飼養10 d。給藥前對每只犬稱重，且在給藥前16 h和給藥后8 h禁食。 22只犬隨機分為2組，A組和B組，每組各11只，該試驗采用單劑量、雙周期、雙序列交叉設計給藥，第1周期A組犬以30 mg/kg BW口服Rilexine?300(參比制劑)，B組犬以30 mg/kg BW口服Trolevis?300(受試制劑)；第2周期A組犬以30 mg/kg BW口服Trolevis?300(受試制劑)，B組犬以30 mg/kg BW口服Rilexine?300(參比制劑)。兩階段給藥間隔期為7 d。

于給藥前(0 h)及給藥后0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、6、8、12、17和24 h采血。每次從臂頭靜脈采集2 mL血樣至含有肝素鋰的采血管中，6 000 r/min離心5 min，取血漿層，平均分為2份，置于標記好的試管中，-20 ℃保存待用，在21 d內進行分析。

1.3 色譜條件

流動相：0.1%甲酸水溶液；0.1%甲酸-乙腈溶液。

超高效液相色譜儀：Waters Acquity UPLC；色譜柱：BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；流速：0.225 mL/min；柱溫：25 ℃；進樣量：5 μL(表1)。

1.4 質譜條件

質譜儀：Waters Quattro Premier；離子源：電噴霧離子源；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：多反應監測；離子源溫度：130 ℃；脫溶劑溫度：350 ℃；毛細管電壓：3.0 kV；脫溶劑氣流速：850 L/h；Q1、Q3均為單位分辨率(表2)。

1.5 樣品處理

取200 μL血漿，加20 μL甲醇，渦動10 s。加入300 μL乙腈-甲醇(1∶1)，渦動2 min。4 ℃、12 000 r/min離心20 min，取上清200 μL，加入200 μL含有0.1%甲酸的乙腈-水溶液(1∶9)，渦動10 s，12 000 r/min離心10 min，取上清進行UPLC-MS/MS分析。

1.6 方法學驗證

1.6.1 特異性 分析空白犬血漿(n=20)，觀察在藥峰出現的區域是否有干擾信號。

1.6.2 標準曲線 分別設置6個不同濃度的基質添加標準工作液，依次為100、200、500、1 000、2 000和5 000 ng/mL，依據設定濃度加入標準溶液，以所得峰面積為縱坐標，以相應的濃度為橫坐標繪制基質標準曲線。

1.6.3 檢測限與定量限 本試驗中采用信噪比法分別以3倍信噪比和10倍信噪比作為檢測限和定量限。

1.6.4 準確度與精密度 通過添加回收試驗驗證方法的準確度與精密度，分別用回收率和變異系數表示準確度和精密度。選擇以最低定量限及低、中、高(200、1 000和4 000 ng/mL) 4個濃度進行添加回收。每個濃度6個平行，持續3 d，分別計算回收率、日內變異系數和日間變異系數。

1.6.5 穩定性試驗 分別添加200、1 000和4 000 ng/mL頭孢氨芐標準品于血漿中混勻，每個濃度設置3個平行，分別按照下面的操作進行穩定性試驗。

1.6.5.1 凍融穩定性 將混勻的樣品置于-20 ℃冰箱中反復凍融3次，與新鮮添加的血漿樣品同時進行檢測，檢測待測物在凍融過程中的穩定性。

1.6.5.2 室溫穩定性 將混勻的樣品置于室溫12 h后與新鮮添加的血漿樣品同時進行檢測，分析樣品在室溫的穩定性。

1.6.5.3 前處理后穩定性 將混勻的樣品進行前處理，方法同1.5,分別在前處理結束后0和8 h檢測樣品，分析前處理后待測藥物的穩定性。

1.6.5.4 在血漿中的穩定性 將混勻的樣品分別在第0和40天進行前處理檢測，方法同1.5,分析待測藥物在血漿中的穩定性。

1.6.6 基質效應考察 取適量空白血漿樣品，以1∶6體積比加入乙腈-甲醇(1∶1)沉淀蛋白，渦旋1 min后，4 ℃、12 000 r/min離心20 min，取上清液200 μL，加入待測化合物系列質控樣品工作液20 μL，制備低、中、高3個濃度(200、1 000和4 000 ng/mL)的上清液樣品，待前處理后，取上清液進行UPLC-MS/MS分析。每一濃度進行6個重復樣本分析。

取200 μL純凈水代替空白血漿樣品，加入待測化合物系列質控樣品工作液20 μL，制備低、中、高 3個濃度(200、1 000和4 000 ng/mL)的參照溶液樣品，待前處理后，取上清液進行UPLC-MS/MS分析。每一濃度進行6個重復樣本分析。以上清液樣品的峰面積與參照溶液的峰面積均值的比值計算基質效應。

1.7 數據分析

數據分析和方法驗證均符合《生物分析方法驗證指南》[21]。使用WinNonlinTM8.1 軟件中的非房室模型進行分析，計算血漿藥代動力學參數消除半衰期(T1/2)、達峰時間(Tmax)、達峰濃度(Cmax)、血藥濃度-時間曲線下面積(AUC0-t)等，并計算受試制劑與參比制劑Cmax、AUC0-t、AUC0-∞幾何均數的比值以判斷受試制劑與參比制劑是否等效。根據藥代動力學結果計算相對生物利用度(F)。

F=(AUCT·DR)/(AUCR·DT)×100%

式中，AUCT，受試制劑的曲線下面積；DR，參比制劑的給藥劑量；AUCR，參比制劑的曲線下面積；DT，受試制劑的給藥劑量。

2 結 果

2.1 方法學試驗結果

2.1.1 特異性 由圖1可知，在分析物的保留時間3.07 min附近未檢出影響頭孢氨芐的干擾峰，不存在明顯的內源性物質的干擾，說明該方法的特異性良好。

2.1.2 標準曲線 由圖2可知，頭孢氨芐的血漿藥物濃度在100～5 000 ng/mL濃度范圍內方法的線性關系良好，相關系數(R2)≥0.99。以峰面積為縱坐標，藥物濃度為橫坐標，標準曲線方程為：y=10.6828x-176.481。

2.1.3 檢測限和定量限 本試驗分別以3倍信噪比和10倍信噪比作為檢測限和定量限。 6個平行樣品測出檢測限為50 ng/mL，定量限為100 ng/mL。

2.1.4 準確度和精密度 血漿中頭孢氨芐UPLC-MS/MS測定結果顯示，空白血漿中頭孢氨芐添加濃度為100、200、1 000和4 000 ng/mL時平均回收率為92.44%～111.29%，回收率穩定；空白血漿添加樣品在100～5 000 ng/mL范圍內，日內變異系數均≤10.35%，日間變異系數均≤10.05%，精密度良好(表3)。

2.1.5 穩定性試驗結果 分別添加200、1 000和4 000 ng/mL 3個不同濃度頭孢氨芐標準品的血漿樣品在前處理后、室溫12 h后、血漿中40 d后及-20 ℃反復凍融3次的過程中待測藥物的響應值的變異系數均<20%。

2.1.6 基質效應 基質效應考察結果顯示，頭孢氨芐在200、1 000和4 000 ng/mL 3個血漿濃度樣品中檢測的基質效應變異系數均≤3.63%，滿足≤15%的要求，故此分析方法的基質效應可忽略不計。

2.2 血藥濃度及藥代動力學特征

犬以30 mg/kg BW單次口服頭孢氨芐片參比制劑和受試制劑后，不同時間測得的受試制劑與參比制劑對應的平均血藥濃度-時間曲線見圖3。由圖3可知，受試制劑與參比制劑的峰濃度分別為26.82和28.09 μg/mL,而兩者達峰時間分別為2.70和1.77 h，均較接近，且兩條曲線也較吻合。采用WinNonlinTM8.1軟件對藥代動力學參數進行分析，結果顯示，受試制劑與參比制劑的AUC0-t分別為(116.34±36.30) μg·h/mL和(121.81±25.80) μg·h/mL，其他藥代動力學參數同AUC0-t，受試制劑與參比制劑的差異較小(表4)。根據公式計算可得頭孢氨芐片受試制劑的相對生物利用度為99.78%。

表4 頭孢氨芐2種制劑的藥代動力學參數(以實際給藥劑量計算)

2.3 生物等效性評價

WinNonlinTM8.1軟件分析顯示，受試犬單次口服30 mg/kg BW頭孢氨芐片，受試制劑與參比制劑Cmax、AUC0-t和AUC0-∞幾何均數的比值分別為99.51%、99.27%和99.30%，其90% CI均在80.00%～125.00%之間(表5)，表明頭孢氨芐片受試制劑和參比制劑具有生物等效性。

表5 頭孢氨芐2種制劑生物等效性分析參數(以實際給藥劑量計算)

3 討 論

頭孢氨芐的藥代動力學研究主要采用HPLC和LC-MS/MS方法，Papich等[16]采用HPLC方法研究犬口服頭孢泊肟酯和頭孢氨芐的藥代動力學、蛋白質結合和組織分布，其色譜柱規格為4.6 mm×150 mm，保留時間為7.2～7.4 min；do Nascimento等[19]采用LC-UV-MS/MS方法研究氨芐青霉素和頭孢氨芐在水溶液和人血漿中的短期穩定性，色譜柱規格為4.6 mm×250 mm，運行時間為18 min，保留時間為15.4 min；Qi等[22]采用HPLC方法研究犬血漿中頭孢氨芐和甲氧芐啶的藥代動力學，色譜柱規格為4.6 mm×250 mm，運行時間為16 min，保留時間為5.3 min。 本試驗建立了犬血漿中頭孢氨芐的UPLC-MS/MS方法，該方法靈敏度和準確度較高，色譜柱規格為2.1 mm×100 mm，運行時間為5 min，保留時間為3.07 min。上述文獻中使用的色譜柱均比本試驗所使用的色譜柱更長，較長的色譜柱導致流動相消耗增加，單個樣品儀器運行時間及頭孢氨芐保留時間延長，儀器被污染的幾率增加。此外，HPLC的流動相一般較復雜，加入的試劑雜多，Hussein等[20]用HPLC快速方法分析測定人血漿中頭孢氨芐水平和穩定性，其流動相由等體積的0.01 mol/L十六烷基三甲基溴化銨和0.01 mol/L磷酸氫二鉀-乙腈-三乙胺(60∶40∶0.001)組成；Qi等[22]相關研究中流動相由2 mol/L的甲酸鈉緩沖液(pH 3.5)-甲醇-乙腈(22∶7∶7)組成。在本試驗中，流動相為0.1%甲酸水溶液和0.1%甲酸-乙腈溶液，流動相所含溶液較常見且配制簡單，上述文獻中的流動相配制更復雜，且加入的試劑較多，對環境的不利影響更大。 除此之外，在Hussein等[20]相關研究中頭孢氨芐定量限為500 ng/mL，Qi等[22]相關研究中頭孢氨芐定量限為1 000 ng/mL，在Albarellos等[17]研究中頭孢氨芐定量限為390 ng/mL,而本試驗建立的犬血漿中頭孢氨芐檢測方法定量限為100 ng/mL，比上述文獻定量限更低，能更全面滿足頭孢氨芐在犬體內的藥代動力學研究。

Prados等[14]對犬口服5%頭孢氨芐懸浮液(25 mg/kg)的時間藥代動力學研究結果顯示，早上10：00和晚上10：00喂藥Cmax分別為(18.77±2.80)和(14.52±2.70) μg/mL，Prados等[23]關于甲氧氯普胺改善犬口服頭孢氨芐的藥代動力學研究結果顯示，犬單次口服5%的頭孢氨芐懸浮液(25 mg/kg)和靜脈注射鹽酸甲氧氯普胺(0.5 mg/kg)20 min后再口服5%的頭孢氨芐懸浮液(25 mg/kg)，早上10：00和晚上10：00喂藥其Cmax分別為(18.77±2.83)和(21.88±0.85) μg/mL，可知與甲氧氯普胺聯合使用改變了頭孢氨芐在體內的藥代動力過程，增加了頭孢氨芐的 Cmax。Yin等[13]對頭孢氨芐胃浮片的研究中，犬單次口服500 mg頭孢氨芐胃漂浮片，Cmax為(22.87±4.11) μg/mL。不同頭孢氨芐制劑在體內的吸收速度和程度都會有一定的差異。在本試驗中，受試制劑在(2.70±4.68) h達到Cmax(26.82±7.94) μg/mL，此制劑吸收較迅速。與胃漂浮片相比，雖然給藥劑量更小，但本試驗中頭孢氨芐片受試制劑(Trolevis?300)的Cmax較高，說明其吸收程度較高，在血液中的濃度較高，藥效相對較強。Prados等[14]研究結果顯示，頭孢氨芐懸浮液的T1/2分別為(1.79±0.20)和(2.69±0.90) h。在本試驗中，受試制劑的T1/2為(3.12±1.05) h，比上述研究中的T1/2更長，表明本試驗中頭孢氨芐片受試制劑(Trolevis?300)在體內的消除率更低，治療效果持續時間更長，這意味著可延長連續給藥的間隔。與上述文獻中的頭孢氨芐制劑相比，頭孢氨芐片(Trolevis?300)具有吸收更快、消除率更低等優點，優于上述文獻中的頭孢氨芐制劑。在本試驗中，參比制劑在(1.77±0.55) h達到Cmax(28.09±5.09) μg/mL，T1/2為(3.39±1.43) h。犬口服頭孢氨芐受試制劑和參比制劑后，Ln(Cmax)、Ln(AUC0-t)和Ln(AUC0-∞)比率分別為99.51%、99.27%和99.30%，根據生物等效性研究技術指導原則[24]，此受試制劑與參比制劑具有生物等效性，且具有臨床應用價值。

4 結 論

本試驗成功建立了頭孢氨芐在犬血漿中的UPLC-MS/MS檢測方法，該方法線性、準確度、精密度和靈敏度均符合相關要求，且特異性高、穩定性良好。藥代動力學過程分析結果顯示，頭孢氨芐片受試制劑在犬體內具有吸收快、消除緩慢等特點，且頭孢氨芐片受試制劑和參比制劑具有生物等效性，據此，可認為2種制劑具有相似的臨床療效和臨床安全性，均可用于臨床上犬相關疾病的治療。