睪丸間質細胞線粒體調控睪酮合成的研究進展

常雪蕊，郭 勇，齊曉龍，陳 余，王 梁，盛熙暉，王相國，邢 凱，肖龍菲，倪和民

(1.北京農學院動物科學技術學院，北京 102206；2.北京市畜牧總站，北京 100107)

睪丸間質細胞(Leydig cells,LCs)合成與分泌的睪酮是雄性動物最重要的雄激素之一，其可刺激雄性生殖器官發育成熟并維持其機能，促進精子的發生及成熟，促進蛋白質的合成，特別是肌肉、骨骼以及生殖器官蛋白質的合成，睪酮的合成還存在負反饋調節機制，以保證睪酮分泌處于相對穩定的水平[1]。鑒于睪酮的以上重要生理功能，調節睪丸間質細胞合成與分泌睪酮的研究越來越受到關注。近年來，大量研究表明，睪丸間質細胞合成分泌睪酮與線粒體密切相關，線粒體結構和功能的完整性直接影響睪酮的生物合成[2-4]。作者簡述了睪丸間質細胞內睪酮合成的分子機制及影響睪酮合成的重要因子，并從線粒體結構、線粒體氧化損傷、線粒體調控的細胞調亡和線粒體的生物發生多個角度論述線粒體影響睪丸間質細胞合成睪酮的作用機制，旨在為進一步研究睪丸間質細胞中的線粒體影響睪酮合成的作用靶點及改善雄性動物睪酮分泌并提高其繁殖性能提供參考。

1 睪丸間質細胞與睪酮合成的機制及關鍵影響因子

1.1 睪丸間質細胞

睪丸間質細胞最早于1850年在大鼠中首次被發現并命名[5]，為分布在睪丸生精小管之間的疏松結締組織，其主要功能是合成和分泌睪酮。盡管睪丸間質細胞在睪丸細胞中占比較少，但體內超過90%的睪酮是由睪丸間質細胞分泌的。哺乳動物睪丸間質細胞可分為胚胎期的胎兒型睪丸間質細胞(fetal Leydig cells,FLCs)和出生后生成的成熟型睪丸間質細胞(adult Leydig cells,ALCs)[6]。胎兒型睪丸間質細胞在胚胎發育期間就開始大量合成睪酮，此時的睪酮可以維持雄性生殖器官生長發育和胎兒大腦的正常發育。在胎兒出生后，胎兒型睪丸間質細胞數量下降，睪酮分泌與合成也隨之下降。隨著新生睪丸干細胞中成熟型睪丸間質細胞的發育，睪酮逐漸升高恢復至機體生長發育所需的正常水平[7]。目前，針對睪丸間質細胞開展的各項體內外研究均趨于成熟，為探究睪丸間質細胞的功能及其調控機制奠定了基礎。

1.2 睪酮合成的機制

睪酮主要由睪丸間質細胞合成并分泌，其合成過程受下丘腦-垂體-睪丸軸(HPT)、轉錄因子和輔酶因子的調控。在下丘腦合成和釋放的促性腺激素釋放激素(GnRH)的刺激下垂體前葉釋放能夠刺激睪丸間質細胞合成睪酮的促黃體生成素(LH)。LH與睪丸間質細胞的膜受體結合，再與G蛋白偶聯，刺激睪丸間質細胞激活腺苷酸環化酶使ATP轉變為cAMP，進一步激活腺苷酸環化酶和蛋白激酶的表達,進而生成睪酮。同時睪酮的生成對GnRH、LH的分泌具有負反饋調節作用，使得機體內睪酮維持在正常的生理水平[8-10]。膽固醇是睪丸間質細胞合成睪酮的原料，位于線粒體外膜上的類固醇合成急性調節蛋白(steroidogenic acute regulatory protein,StAR)能促進膽固醇向線粒體的內膜轉運，隨后在線粒體內膜膽固醇側鏈裂解酶(cholesterol side-chain cleavage cytochrome,P450scc)的催化下生成孕烯醇酮，再通過光面內質網的羥基類固醇脫氫酶(3β-hydroxysteroid dehydrogenase,3β-HSD)和轉運蛋白(translocator protein,TSPO)的共同作用合成睪酮[9]。在體外試驗中，在小鼠睪丸間質細胞(TM3)中添加75 μg/mL芹菜、金盞花的提取物能顯著提高睪丸間質細胞的活力，增加睪酮的合成[11]。

1.3 睪酮合成的關鍵影響因子

位于線粒體上的StAR和P450scc是睪酮合成的關鍵限速酶[12]。通過調控StAR、P450scc和TSPO等關鍵基因和蛋白的表達可調控睪酮的合成[13]。如霉菌T-2毒素的抑制作用會降低P450scc和StAR的轉錄水平，導致小鼠睪丸間質細胞內睪酮合成減少[14]。給小鼠直接飼喂大豆油會提高睪丸間質細胞中類固醇合成StAR、P450scc蛋白的表達，使睪酮合成與分泌增加[15]。

1.3.1 StAR 類固醇合成急性調節蛋白StAR位于線粒體外膜，主要參與類固醇激素(膽固醇)的底物從線粒體外膜向線粒體內膜轉運。研究表明，核轉錄因子(NRF1)可調控StAR的表達，在低氧血癥或缺氧條件下，NRF1的下調可抑制StAR和睪酮的合成[16]。低氧誘導因子1(HIF1)與StAR啟動子區域結合并抑制StAR的表達，降低睪酮的合成[17]。在男性生殖方面的研究發現，用適量的類黃酮和異類黃酮等物質可提高StAR的表達，進而促進睪酮合成[18]。

1.3.2 P450scc P450scc又稱為CYP11A1,由CYP11A1基因編碼，位于類固醇激素生成細胞的線粒體內膜上，主要作用是將進入線粒體的膽固醇轉變為孕烯醇酮。睪酮合成的第一步是P450scc切割膽固醇側鏈，也是至關重要的一步。 P450scc在所有類固醇生成細胞(包括睪丸間質細胞、腎上腺皮質細胞、卵巢細胞)中均有表達[19-20]。 如添加100 nmol/L雙酚A(BPA)會通過上調大鼠睪丸間質細胞內P450scc基因及其蛋白表達來促進睪丸間質細胞增殖和分化[21]。研究發現，CYP11A1基因缺失會誘導小鼠睪丸間質細胞內脂質蓄積，進而影響睪酮的合成[22]，抑制CYP11A1和3βHSD的活性及表達水平可顯著減少睪酮的合成[23]。

1.3.3 TSPO 轉運蛋白TSPO是一種保守的線粒體外膜蛋白，在類固醇合成細胞中普遍存在，與多種細胞和組織功能有關，包括類固醇激素的生物合成、呼吸作用、細胞增殖和凋亡[24]。膽固醇是一種高度親脂性的化合物，不能自由擴散，而TSPO對膽固醇有高親和力可以促進其向線粒體內膜轉運。TSPO與StAR結合后促進膽固醇向線粒體內膜轉運并結合到P450scc上，是影響睪酮合成的關鍵步驟[25]。最近對TSPO的研究發現，缺失TSPO基因可直接影響小鼠StAR的合成與加工[26]。 敲除TSPO基因后，小鼠線粒體脂肪酸氧化程度和活性氧(ROS)含量明顯增加，影響線粒體的能量穩態[27]。

此外，研究發現，添加1～10 nmol/L神經介素B7會增強豬原代睪丸間質細胞中關鍵蛋白(StAR、P450scc和3β-HSD)的表達，并顯著促進睪酮的合成與分泌[28]。由此可見，位于線粒體中的StAR、P450scc和TSPO等是睪丸間質細胞調控睪酮生物合成的關鍵調節因子。

2 睪丸間質細胞線粒體與睪酮合成

線粒體是位于真核細胞細胞質中具有雙層膜結構的細胞器，其特有的雙層膜結構上分布著大量酶及酶復合體，是類固醇激素生物合成調控的關鍵控制點，只有在線粒體保持穩定的狀態下睪丸間質細胞才能合成睪酮，而睪酮合成的關鍵限速酶StAR和P450scc的表達依賴于線粒體結構及功能的完整[29]。因此，睪丸間質細胞線粒體結構和功能的改變會直接影響睪酮的生物合成，線粒體損傷則會造成睪酮合成障礙，如不同濃度(1～200 μmol/L)尼古丁會造成小鼠睪丸間質細胞(TM3)的線粒體損傷，并且隨著毒性的增加線粒體活性降低，最終造成睪酮生成障礙[30]。

2.1 線粒體結構與睪酮合成

膽固醇從細胞漿內轉運到線粒體外膜，在StAR幫助下從線粒體外膜再轉移至線粒體內膜，隨后穿過線粒體內膜運輸到線粒體基質內，通過P450scc復合物的作用在內質網內進行進一步合成代謝[31-32]。穩定的線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential,MMP)、合適的pH和持續的ATP合成才能保證StAR發揮作用[33]。線粒體內膜兩側質子及其他離子的分布不均產生負電位差,即線粒體膜電位，而線粒體膜電位是驅動ATP合成的動力[34]。線粒體膜電位的變化會影響線粒體的功能，睪丸間質細胞內對線粒體膜電位產生影響的物質也會改變類固醇合成水平。研究發現，氧化后的低密度脂蛋白(oxLDL)通過破壞電子傳輸鏈并抑制睪丸激素合成相關的蛋白質和酶(StAR、P450scc和3β-HSD)來降低線粒體膜電位，最終導致線粒體功能障礙并減少睪丸間質細胞睪酮的合成[35]。

線粒體結構的改變同樣也會對睪丸間質細胞中睪酮的合成產生影響。研究發現，長期暴露于靜電場的睪丸間質細胞線粒體內外膜間隙擴大，會導致線粒體腫脹，線粒體膜破裂和缺陷，從而使睪酮合成和分泌減少[36]。如轉錄調節因子(transcriptional coactivator with PDZ-binding motif,TAZ)在睪丸間質細胞中誘導類固醇生成酶的表達和睪丸激素產生中起重要作用，TAZ的缺乏會直接導致小鼠線粒體功能障礙和溶酶體功能失調，最終造成睪酮合成和分泌減少[37]。研究發現，在小鼠成熟的睪丸間質細胞中添加200 μmol/L 4-甲基兒茶酚可顯著降低線粒體活性而減少睪酮分泌[38]。因此，線粒體膜電位及結構的改變會影響睪丸間質細胞進而影響睪酮合成。

2.2 線粒體氧化損傷與睪酮合成

線粒體呼吸鏈的氧化磷酸化系統主要由線粒體呼吸鏈酶組成。在電子傳遞鏈中起關鍵作用的酶分別是NADH氧化還原酶(復合體Ⅰ)、細胞色素b(復合體Ⅲ)和細胞色素C(CytC)氧化酶(復合體Ⅳ)[39]。線粒體在正常的新陳代謝過程中會生成ATP，同時產生氧負離子(O2-)。細胞中的氧負離子是ROS的前體，主要由呼吸鏈中的蛋白酶復合體Ⅰ、Ⅲ產生[40-41]。

正常情況下，ROS的濃度在機體內會保持穩態[42]，而在ROS濃度過高時就會造成氧化應激。氧化應激是影響睪丸間質細胞生殖功能的主要因素之一，線粒體作為氧化應激的主要靶點，易受到ROS的攻擊，造成線粒體結構和功能的損傷并破壞睪丸間質細胞的類固醇生成能力[43]。過量的ROS會導致線粒體膜結構損傷，進而降低線粒體膜電位。線粒體膜電位參與ATP的合成、線粒體內的氧化還原反應和細胞增殖與凋亡等多種功能，同時維持線粒體膜電位的穩態也是線粒體氧化磷酸化發生必備的基礎條件。因此，線粒體膜電位的降低會直接造成線粒體氧化損傷[44]。此外，細胞內ROS大量積聚可引起線粒體呼吸鏈的破壞，從而導致ATP生成減少[40]。大量體內外試驗都表明，ROS會造成線粒體損傷，進而破壞睪丸間質細胞的結構和功能，誘導睪丸間質細胞凋亡，影響睪酮的生物合成，對生殖系統造成嚴重危害[45-46]。研究表明，過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活物1α(PGC-1α)是ROS的抑制因子，PGC-1α缺失的小鼠對氧化應激的敏感性增強，而提高PGC-1α表達可顯著保護細胞免受氧化應激介導的死亡[47]。抑制山羊PGC-1α表達可降低調控睪酮合成StAR、P450scc等關鍵基因的表達，從而抑制睪丸間質細胞的睪酮分泌[48]。因此，調控ROS的產生，避免線粒體的氧化損傷，進而保護睪丸間質細胞促進睪酮合成與分泌，有望成為新的研究熱點。

2.3 線粒體調控的細胞凋亡與睪酮合成

線粒體作為體內重要的代謝調節中樞，通過傳遞調節信號來控制細胞的功能，在細胞凋亡過程中具有重要的意義。線粒體不僅是細胞主要的供能細胞器，也是調控細胞凋亡的重要細胞器。細胞凋亡是細胞程序化死亡過程，是精確調節細胞數量和去除有害細胞(如被病毒感染的細胞和腫瘤細胞等)的主要途徑[49]。盡管細胞凋亡的調控因物種的不同而有所不同，但在哺乳動物中，細胞凋亡主要通過線粒體進行調控，線粒體自身結構和功能的改變及外界環境的改變均可影響細胞凋亡[50]。

CytC存在于線粒體內膜外側，參與線粒體呼吸鏈電子傳遞。同時，CytC也參與細胞凋亡過程，CytC由線粒體釋放到細胞質內這一過程被認為是控制細胞凋亡的關鍵環節[51]。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶家族(Caspase)是細胞凋亡特異性的蛋白酶，線粒體在此蛋白酶的激活中起著關鍵作用[52]。B細胞淋巴瘤-2蛋白家族(Bcl-2)包括抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白，主要作用于線粒體外膜，通過調節線粒體膜孔隙進而調控促凋亡因子的釋放，參與線粒體介導的細胞凋亡過程[53]。此外，由線粒體產生的ROS也可參與凋亡信號的傳導。線粒體產生的ROS會隨著時間而逐漸積累，最終導致DNA損傷、細胞凋亡[54]。因此，線粒體可通過調節睪丸間質細胞的凋亡而影響睪酮的合成與分泌。鈣離子結合蛋白的過表達會降低線粒體相關凋亡因子(如Caspase-9和CytC)的表達，增強睪丸間質細胞的活力和增殖活性[55]。有研究表明，在大鼠的飲用水中添加1%牛磺酸可提高Bcl-2的表達并降低CytC和Caspase-3等蛋白的表達，增強線粒體內蛋白的抗凋亡活性從而抑制睪丸間質細胞的凋亡[56]。因此，通過線粒體途徑調控睪丸間質細胞凋亡發生過早或過多均可降低睪酮水平，從而直接影響雄性動物的繁殖性能。

2.4 線粒體的生物發生與睪酮合成

線粒體的生物發生(mitochondrial biogenesis)是一個復雜的生物過程，指現有的線粒體通過線粒體數量的增加及酶活性的增強從而變成新的線粒體。線粒體中存在著機體細胞核及線粒體自身的DNA和RNA，所以線粒體的整個生物發生過程受細胞核基因組和線粒體基因組的雙重調控。線粒體的生物發生伴隨著線粒體大小、數量和質量的變化，同時通過促進線粒體氧化磷酸化和ATP合成改變線粒體的功能和結構[57-59]。

線粒體的生物發生是由多種因素引起的，如熱量產生和氧化應激、細胞分裂和更新以及分化等，其受到來自激素、細胞內信號通路、核轉錄因子等的密切調控[60-61]。線粒體生物發生的最主要調節因子是過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活物1α(PPARGC1A/PGC-1α)，激素、第二信使(鈣離子、cAMP)和激酶途徑(PKA、MAPK、PRKAA2)等均可通過調節PPARGC1A的表達、蛋白定位或翻譯后修飾起調節作用[62-63]。在小鼠上的大量臨床試驗結果顯示，PGC-1α的表達可調控線粒體DNA損傷通路，缺失PGC-1α基因的小鼠線粒體生物發生會受到直接影響[64]。多環芳烴苯并[a]芘(B[a]P)和二羥環氧苯并芘(BPDE)作為環境中廣泛分布的污染物，可通過改變IRT1/TERT/PGC-1α途徑抑制線粒體的生物發生，最終導致睪丸間質細胞內睪酮合成水平的下降[65]。胰島素會影響小鼠睪丸間質細胞中線粒體生物發生的主要因子PPARGC1A及其下游靶基因線粒體轉錄因子(Tfam)的表達導致睪酮分泌減少[66]。此外，外界壓力對大鼠睪丸間質細胞產生的應激反應可通過線粒體的生物發生來緩解，以保證睪酮的正常合成[67]。

3 小 結

綜上所述，睪酮合成與睪丸間質細胞的線粒體結構和功能密切相關，線粒體氧化損傷、能量代謝、生物發生和線粒體凋亡等均可直接或間接影響睪丸間質細胞睪酮的合成與分泌。目前大量試驗都已經證實通過不同的條件處理睪丸間質細胞會影響睪酮合成，但是線粒體影響睪酮合成的信號通路仍不明確，通過改善睪丸間質細胞中線粒體結構和功能促進睪酮合成的作用機制仍有待進一步深入研究。隨著線粒體影響睪酮合成的作用靶點和作用機制的研究不斷深入，將為研究雄性動物生殖內分泌的調控提供新的思路和途徑。