Xist lncRNA介導X染色體失活及應用研究進展

陶維昆，劉 波，黃 飛，王 杰，高慶華，3

(1.新疆塔里木大學動物科學學院，阿拉爾 843300；2.新疆塔里木大學生命科學學院，阿拉爾 843300；3.新疆生產建設兵團塔里木畜牧科技重點實驗室，阿拉爾 843300)

X染色體失活(X chromosome inactivation,XCI)作為表觀遺傳調控的一種重要且獨特的機制，在雌性哺乳動物中可將一條X染色體包裝成異染色質失去活性，使其基因功能受到抑制而沉默；在雌性哺乳動物中一條X染色體失去轉錄活性，一方面可平衡雌雄性間X連鎖基因表達水平，防止出現過度表達情況；另一方面可平衡X連鎖基因與常染色體間基因表達，上調有活性X染色體上的基因表達水平[1]。 X染色體失活中心(X chromosome inactivation center，XIC)是主要的調控區域，X-非活性特異性轉錄物(X-inactive specific transcript，Xist)位于該區域中，是調控染色體失活的主效基因。失活的染色體可誘導Xist編碼長15～17 kb的長鏈非編碼RNA(long chain noncoding RNA，lncRNA)，并在其上積累，同時招募其他因子對染色體進行修飾和沉默X連鎖基因。近年來，隨著Xist lncRNA的重要功能元件、RNA互作結合蛋白(RNA interaction binding protein，RBP)、下游染色體修飾和基因沉默途徑等方面的新發現越來越多，XCI引起了研究者的廣泛關注。對人、小鼠、兔和牛等物種研究發現，XCI在不同物種、不同時期及雌雄性胚胎之間存在差異[2-3]。此外，其與人類疾病也有關聯[4-5]，如Xist lncRNA作為競爭性內源RNA(ceRNA)參與腫瘤和其他人類疾病的發展[6]。作為哺乳動物生物學基礎的重要組成部分，XCI在整個生命過程中發揮著不可替代的作用。作者就Xist lncRNA介導XCI的主要分子機理、調控機制及在不同物種中的研究進行綜述。

1 XCI發現與理論假說

1949年，Barr在雌貓有絲分裂間期神經細胞核中發現一種小體；1960年，Ohno等發現在雌性動物細胞中含有異常固縮的染色體[7]；1961年，Lyon等證實其為一條無轉錄活性的X染色體，且在細胞增殖過程中會向后穩定傳遞[8-9]。此后，研究者對這一生物學現象進行了總結[10]：①雌性哺乳動物細胞中僅有一條有轉錄活性的X染色體，另一條X染色體發生異常固縮而失活，其上大部分基因失去轉錄活性；②X染色體失活發生于胚胎早期發育過程中；③失活是隨機發生的，可為父源遺傳失活，也可為母源遺傳失活；④失活的X染色體在細胞的有絲分裂過程中能夠穩定地向后傳遞。 X染色體失活中心(X chromosome inactivation center，XIC)、長散在重復序列元件(long interspersed nuclear elements，LINE)、L1重復序列元件等在染色體失活過程中對X染色體基因抑制沉默發揮著重要作用[11]。

2 XCI調控機理

2.1 XCI的3個階段

XCI是一種復雜的生物過程，伴隨DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質凝縮、多種相關復合物富集等多種生物學變化[12]。簡單來說，包括3個階段：①起始階段，細胞通過自主性表觀遺傳機制識別未來不活躍的X染色體，進而啟動并觸發在該X染色體上的Xist轉錄，并形成Xist lncRNA轉錄聚集；②建立階段，Xist lncRNA覆蓋到該X染色體上促使其大部分基因失去轉錄活性，從而抑制其轉錄；③維持階段，失活的X染色體依舊能夠合成Xist lncRNA用以維持自身的失活狀態，在細胞經過多個分裂周期后，失活的X染色體經多次復制拷貝仍舊會保持這種失活狀態被傳遞。當同一細胞核內其中一條X染色體被作為失活染色體傳遞時，另一條X染色體在傳遞過程則保持該轉錄活性狀態被傳遞[13]。

2.2 Xist lncRNA在失活染色體上的擴散方式

Xist lncRNA結合到失活染色體上是X染色體失活的關鍵一步。目前關于Xist lncRNA在X染色體上結合與擴散方式仍存在不同說法。Gartler等[14]提出，可能存在一些站點式的位點促進和推動Xist lncRNA傳播，使X染色體上的基因發生沉默。X染色體上富含LINE類型的分散重復元件很有可能就是這些位點[15]，Xist lncRNA與特定的位點進行跳躍式的結合，并從少數有限的募集位點向外傳播可能是其中的一種模式。Xist lncRNA可能是利用染色體的空間結構，最先失活與Xist基因空間位置上較接近的基因，而后隨著Xist lncRNA擴散至整條X染色體，最終使X染色體轉錄沉默[16-17]。Sunwoo等[18]在高分辨率顯微鏡下對小鼠單個細胞失活X染色體觀察時發現，Xist lncRNA量比預測的要少，推測Xist lncRNA的傳播可能存在著另一種“擊-跑模式(hit and run model)”。Simon等[19]借助RNA序列靶點捕獲雜交技術對4種處于不同階段的雌性小鼠細胞檢測發現，當X染色開始失活時，Xist lncRNA先擴散至整條即將失活的X染色體靶向基因的富集區，然后富集區向靶向基因貧瘠區進一步擴散；利用鎖定核酸(locked nucleic acid,LNA)對小鼠胚胎成纖維細胞Xist lncRNA進行去除發現，Xist lncRNA會在幾小時內重新覆蓋到基因富集區和貧瘠區。因此，在維持階段當XCI受到干擾時，細胞會自主啟動應急機制，并短時間內迅速恢復至X染色體失活狀態，不需要像最初失活時那樣由富集區向靶向基因貧瘠區進一步擴散，這一發現表明在XCI起始階段和維持階段Xist lncRNA擴散方式可能存在差異。此外，X染色體上富含的一些特殊元素可協助Xist與Xist lncRNA介導的順式傳播沉默，這一關鍵元素再一次被指向X染色體上富含的LINE重復片段[1，19]。

2.3 Xist及其反義轉錄本(Tsix)在XCI調控中的作用

XIC作為主要的調控區域，不活躍的X染色體能夠誘導XIC編碼的多個lncRNA調控，包括Xist和Tsix等結合到XIC，進而富集更多的染色體修飾相關復合物，促使蛋白質沉積和形成異染色質構象[20]，從而抑制X染色體的轉錄活性。隨著研究的深入，發現Tsix在XIC中位置與Xist重疊，Tsix介導抑制Xist的轉錄活性，但具體分子機制尚未完全明確。Tsix參與Xist啟動子區組蛋白修飾狀態的轉換以及DNA甲基化酶Dnmt3a等的富集，然而在失活染色體的啟動子和增強子處，通常組蛋白乙酰化程度較高，組蛋白H3K4me3較為豐富，并促進組蛋白H3K36me3的富集[21-22]。此外，失活染色體在一定程度上也促進了其他相關的組蛋白富集，如H3K27me3、H2AK119ub1、H3K9me2/3和變體組蛋白macroH2A[23-24]。對Tsix缺失的XY胚胎干細胞研究發現，胚胎早期發育過程中Xist基因表達呈顯著上調趨勢，Oct4、Nanog、Sox2等轉錄因子通過驅動Tsix的表達或抑制Xist激活因子Rnf12，從而抑制Xist[25]。Oct4通過與Tsix和Xist結合調控這一過程，胚胎干細胞中Oct4緊密結合在Xist基因內含子上，直至分化過程中會逐漸減少，同時結合到Xist上的Tsix會增多[26]。因此充分肯定了Xist與Tsix的反義調控作用，同時表明這一過程中還有其他多種物質和機制的參與。

2.4 Xist lncRNA參與介導XCI

Xist lncRNA與失活X染色體的結合使該條染色體轉錄活性明顯降低，在這該過程中Xist lncRNA所募集的蛋白通過直接或間接的方式參與介導XCI基因沉默的發生，如轉錄抑制蛋白SHARP(又稱SPEN)可能通過不同途徑與Xist相互作用，募集組蛋白脫乙酰酶HDAC3、甲狀腺激素受體SMRT[22]。在Xist lncRNA募集的成分中，數量最多的蛋白是核基質蛋白HndrnpK，它參與到PRC1和PRC2復合物的募集中，導致抑制標記物H2AK119ub和H3K27me3的沉積，從而促進沉默發生[23，27]。在失活X染色體上PRC2密度呈下降趨勢，而后趨于穩定，而H3K27me3仍與Xist lncRNA的富集程度呈正相關[28]。由此說明，XCI過程中Xist lncRNA的豐富度與甲基化酶H3K27me3、多疏抑制復合體PRC2等存在密切互作機制。在X染色體異常固縮的活性轉變過程中，Xist lncRNA聚集在失活染色體之后才發生H2A1.2的募集增加和組蛋白H4的低乙酰化，而H3-K9的甲基化與Xist lncRNA結合到X染色體幾乎同步發生。說明在XCI過程中，Xist lncRNA募集的活性物質存在時序性積累和作用順序。有研究認為，SPOC結構域是SPEN的一個關鍵區域，很可能是SPEN參與介導XCI并發揮作用的關鍵位點，但必須通過其他的HDAC3依賴途徑促使XCI基因沉默發生；進一步研究發現，Xist lncRNA能夠介導募集其他轉錄因子形成多梳抑制復合體PRC1、PRC2，并誘導組蛋白抑制標記物H3K27me3，同時消除RNA聚合酶Ⅱ(RNAPⅡ)，從而保證CPG島DNA甲基化和組蛋白變體macroH2A的沉積，共同參與維持已失活基因保持該沉默狀態[28-29]。

3 染色體失活逃逸現象

由于X染色體上存在一些短的成對片段，這些片段若出現缺失或者重復會導致異常表型的發生，因此正常情況下X染色體上并不是所有基因都發生失活。位于X和Y染色體擬常染色質區域(pseudo-autosomal region,PAR)的成對基因可能存在失活逃逸現象[9]。研究發現，X染色體短臂遠末端區域大多數X-連鎖基因在胚胎早期發育過程中表現出穩定的轉錄失活特征，而少數未被沉默的基因主要存在于與Y染色體同源性較高的區域部分，此外游離在沉默區域之外的非同源區域中少部分基因也會存在免于失活現象[29-30]。失活染色體上約15%的基因不發生失活，這部分逃逸基因在個體、組織、細胞中失活狀態各不相同[31]。逃逸基因啟動子區的甲基化水平明顯低于失活基因。在小鼠中通過敲除Dxz4和Firre基因可破壞失活染色體的空間結構，逃逸基因序列也隨之發生改變[32]。

部分逃逸基因在組織間是相同的，而另一些則具有組織特異性。在成年老鼠組織中發現的失活逃逸基因與胎盤滋養層細胞中檢測出的逃逸基因存在差異。胎盤滋養細胞中XCI為父源性印跡失活，由此提示印跡和隨機失活間存在明顯差異。失活X染色體上某些特定基因表達水平在組織間存在較大差異，進一步說明逃逸現象具有組織特異的劑量效應[33]。因此，XCI逃逸基因在不同組織和性別間的差異可能是男女性別差異的基礎。目前，隨著研究越來越深入，發現的逃逸基因數量也在增加，然而逃逸基因如何免于失活，其作用機制目前仍不清楚。

4 生殖細胞與早期胚胎XCI的發生

XCI能夠穩定傳遞且在早期雌性胚胎細胞中隨機失活，在這一過程中是如何發生呢？雄性哺乳動物生殖細胞形成過程中精原細胞減數第一次分裂時，同源染色體配對，父源X染色體上多數基因發生轉錄沉默(即印跡失活)，只有少數基因具備轉錄活性，因此精子中X染色體上大部分基因處于相對不活躍狀態。隨著受精的發生，父源X染色體活性會增強[31]。雌性哺乳動物中X染色體的變化表現為失活和復活的循環演變過程。雌性生殖細胞形成階段，減數分裂時期失活的染色體被重新活化，且在分裂過程中能夠穩定遺傳和存在[34]。經減數分裂成單倍體細胞的過程中，每個單倍體的雌性生殖細胞都包含著一條具有轉錄活性的X染色體。而在受精卵形成初期，母源X染色體在母源印跡的保護下免于失活，繼承了父本的X染色體會以基因印跡方式發生失活，而后在隨機XCI啟動前的囊胚期內細胞團中再次出現選擇性地恢復活性，緊接著在胚胎內細胞團中父本和母本的X染色體才開始發生失活[35-36]，且這一次的失活完全隨機。研究發現，在X染色體重新復活過程中靠近Xist的基因復活得最晚[37]，且X染色體活化的同時，其表達水平出現一定程度上調，同時促進常染色體表達比率上升[38]。當失活染色體表現復活現象時，細胞內Xist基因會保持沉默狀態，同時組蛋白抑制標記物也會一起消失，直至復活完成和再次失活開始[39]。

5 不同哺乳動物中XCI的研究

5.1 小鼠XCI

對小鼠早期胚胎研究發現，XCI的模式在哺乳動物中似乎并不保守，胚胎細胞在2-～4-細胞期父源X染色體表現出印跡性失活特征；囊胚胚泡階段內細胞團中失去轉錄活性的X染色體被重新激活，兩條X染色體都具備轉錄活性；直至囊胚后期著床過程中伴隨著內細胞團的分化，上、下胚層細胞X染色體隨機失活機制被再次激活，而外胚層滋養細胞則一直保持父源X染色體失活[40-41]。對小鼠胚外絨毛組織研究發現，母源X染色體具備活性，而父源X染色體保持失活狀態，推測這種現象可能是為避免胚胎著床過程中受到母體免疫攻擊[42]，且該現象只在小鼠中發現。

Oh等[43]研究發現，分化過程中小鼠胚胎干細胞(mESCs)JPX基因編碼的lncRNA對Xist的轉錄有激活促進作用，Xist P2啟動子上的絕緣子結合蛋白(CTCF)被游離出來以解除CTCF對Xist轉錄的抑制作用，從而促進Xist的表達使XCI正常進行，進一步敲除JPX基因發現，其對雌性的胚胎干細胞具有致死性。Nesterova等[44]研究發現，小鼠17號和7號染色體基因簇的親本印跡分別需要Airn和Kcnq1ot1基因座，它們通過一種類似于Xist的機制在Polycomb復合體的長期募集中發揮作用。在hnRNPK誘導作用下，Airn和Kcnq1ot1基因座的lncRNA在滋養層干細胞中形成跨越數百萬個堿基的染色質修飾的多復合順式結構域，且修飾程度與lncRNA基因座鄰近的基因組結構有關，也與lncRNA本身的豐度相關[45-46]。對著床前小鼠胚胎和胚胎干細胞研究發現，SPEN不但對X染色體基因沉默發揮積極作用，而且參與維持神經細胞中XCI，同時SPEN逃避對XCI基因的表達有明顯的抑制作用；SPEN在Xist上調后立即被募集到X染色體，并靶向遷移到活性基因的增強子和啟動子區；基因沉默后SPEN從染色質上迅速脫離，表明SPEN在染色質上的結合是需要主動轉錄的；此外研究人員認為SPOC結構域是SPEN基因沉默的主要效應物，并證明SPOC與Xist RNA的結合足以介導基因沉默[29]。Patrat等[47]鑒定了SPOC的蛋白質伴侶，包括NCoR/SMRT、m6ARNA甲基化酶、NuRD復合物、RNA聚合酶Ⅱ以及參與轉錄起始和延伸調控的其他因子，推測SPEN可能充當XCI起始的分子整合劑，在活性增強子和啟動子區域使得Xist lncRNA與轉錄調控、核小體重塑和組蛋白去乙酰化酶連接在一起，SPOC在該過程中與SPEN共同發揮生物學功能。

5.2 人XCI

近年來，關于人早期胚胎干細胞(hESCs)的形態特征、轉錄組、表觀基因組特征、XCI分子特性等方面研究發現，人和小鼠胚胎干細胞移植后外胚層有類似的多能性狀態，但人植入后胚胎外胚層細胞和植入前囊胚期胚胎干細胞與小鼠存在差異，表明XCI在哺乳動物中具有物種特異性。由于受XCI影響，在X連鎖基因甲基化CpG結合蛋白2(MeCp2)中，分別用綠色熒光蛋白GFP和紅色熒光蛋白tdTomato標記X染色體(Xa-GFP和Xi-tdTomato)，結果發現，人胚胎著床前囊胚內細胞團中大多數細胞兩條X染色體保持活性且轉錄較活躍，大部分細胞中檢測到Xist雙等位基因表達[48]。著床前hESCs外胚層轉錄組中也檢測到高水平TFCP2L1和Xist雙等位基因表達。人早期胚胎中XCI分別開始于桑椹胚至囊胚階段，且不受印跡的影響，此外，在人胚胎ICM中檢測到Xist轉錄物在X染色體周圍出現聚集現象，說明此時正在發生著XCI[49]，進一步證實XCI在哺乳動物中具有物種特異性。然而目前人類這方面的研究模型不夠完善，缺乏理想的系統來研究人早期胚胎發育過程中的X染色體調控機制，因此人XCI的機制尚不明確[50]。

5.3 牛、羊等其他物種XCI

XCI機制研究表明，組蛋白H3K27me3能夠促進Xist表達和XCI發生。研究發現，在牛早期胚胎桑椹胚期前后均能檢測到Xist和組蛋白H3K27me3大量表達，在發育第7天的囊胚中也檢測到Xist lncRNA與組蛋白H3K27me3，第9天表達量仍沒有出現下調，另外在ICM和外胚層前體中也檢測到一定比例的細胞具有Xist lncRNA和組蛋白H3K27me3[51]。此外，JPX RNA通過游離CTCF來激活Xist,從而促進XCI發生，在牛早期胚胎發育過程中，當JPX RNA水平受到干擾后Xist的表達會下調，進而使PGK1、DYNLT3和MSN的表達隨之上調[52]。研究發現，在牛早期胚胎發育不同階段(2-細胞、4-細胞、8-細胞、桑椹胚和囊胚)JPX和Xist都有表達，2-細胞期表達水平很低還未能量化，且隨著胚胎發育相對表達量逐步升高，尤其在桑椹胚階段顯著上調；在不同性別牛胚泡中雌性Xist基因和X連鎖基因表達水平更高，推測X染色體似乎還未完全失活，表明XCI在牛上可能開始于4-細胞到桑椹胚期[53]。何杰[51]對牛胎兒心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟組織中JPX和Xist的相對表達量檢測發現，JPX和Xist在雌性胎兒組織中的相對表達量顯著高于雄性胎兒組織，說明此時不同性別和不同組織間XCI已經完成并維持穩定狀態[52]。研究提出，小鼠和牛早期胚胎胚外組織中可能發生印跡XCI，而人、馬、兔和豬等在發育過程中只發生隨機XCI；Xist基因可能在牛精子細胞中表達，但沒有發現甲基化[54]，具體仍有待進一步研究證實。

目前，在綿羊上也發現了XCI現象，隨著綿羊基因組測序的完成和RNA-Seq技術的進步，為探究綿羊的X染色體劑量補償和X連鎖基因表達提供了新的思路和方法[55]。此外，在小鼠性別鑒定中發現，轉錄SRY基因的睪丸細胞及雄性胚胎從受精卵發育至囊胚的過程中幾乎不轉錄Xist基因；無SRY基因的雌性卵母細胞和雌性胚胎從合子開始到發育至2-細胞的過程中Xist基因不發生轉錄，然而從4-細胞期開始到囊胚期雌性細胞始終保持Xist基因轉錄活性[56-57]。吳霄[57]在探究Xist基因甲基化水平對豬體細胞核移植胚胎克隆效率時發現，Xist基因甲基化水平越低，克隆團囊胚率越高，呈高度負相關，小鼠中也有相似的情況發生。但羊XCI進程中是否也存在與豬、小鼠相似的情況，還需要進一步去探索。

6 小 結

XCI作為雌性哺乳動物一種獨特的發育調控機制和表觀遺傳調控模式，由Xist與Tsix主要調節因子介導，通過DNA甲基化、組蛋白修飾等表觀遺傳修飾調控整個生理過程，對哺乳動物正常生長發育進程意義重大。對人、小鼠、兔和牛等XCI研究表明，其調控機制和分子機理復雜，具有種間特異性，而且似乎沒有遵循統一的模式，同時諸多數據顯示，不同物種間X連鎖基因在XCI啟動后的下調保守性并不一致。值得注意的是，胚胎基因組在小鼠2-～4-細胞期、在人4-～8-細胞期、在兔和牛8-～16-細胞期被激活，由此推測哺乳動物XCI的啟動緊跟著胚胎基因組的激活。同時，XCI這一良好的表觀遺傳學研究模型對于臨床疾病治療具有一定的指導意義。在臨床研究中,XCI的程度與臨床疾病如X連鎖顯性遺傳Alport綜合征、性別特異性流產、Rett綜合征、Menkes病及染色體有關疾病等存在聯系[10]。目前Xist lncRNA被證實參與多種類型腫瘤發展，包括腦腫瘤、白血病、肺癌、乳腺癌和肝癌，在人類疾病特別是癌癥方面起著重要調節功能，并有望用作新的診斷和預測標志物[58]。

Xist lncRNA是表觀遺傳調控中發揮功能的經典范例，盡管其在很大程度上仍無法全面解釋XCI機制，但這方面的研究對基因沉默、異染色質結構和細胞核構成、性別特異性差異產生的機理及遺傳上可能出現的假顯性等方面有更全面的了解。目前這些機制在小鼠和人上研究較多，但在家養哺乳動物上的研究相對滯后。建立XCI的理想體系模型和表型、分子量化分析能夠加快認識哺乳動物種間特異性特征與XCI之間聯系。隨著單細胞RNA-Seq技術的分析效果越來越強，借助高通量技術了解X染色體基因調控和XCI調控機制將成為新的研究助力。