基于轉錄組測序方法研究加替沙星對小鼠的肝損傷作用

國瑞賢，謝廣云*，韓 瑩*

(1．中央民族大學藥學院，北京 100081；2．中國疾病預防控制中心職業衛生與中毒控制所，北京 100050；3．中國食品藥品檢定研究院化學藥品檢定所抗生素室，北京 102629)

【關鍵字】加替沙星；肝毒性；轉錄組學；差異表達基因；小鼠

氟喹諾酮類藥物(fluoroquinolones，FQs)是一種常見的廣譜殺菌藥物，因其與很多抗菌藥物之間的交叉耐藥性比較低，廣泛應用于治療人類、農場動物和鳥類感染性疾病[1-3]。但是在臨床使用中發現，FQs會對患者的肝臟造成一定的損傷[4-6]。曲伐沙星因其有致肝炎甚至嚴重肝衰竭等不良反應被撤出市場[7]。據研究表明[8]，FQs中涉及肝毒性的共有環丙沙星、莫西沙星、氧氟沙星、洛美沙星、諾氟沙星、左氧氟沙星、加替沙星、依諾沙星等8個品種。FQs是我國生產和使用最為常見的一類抗生素，故研究FQs的毒理效應對于其安全性評價具有重要意義。

加替沙星(gatifloxacin，GAT)是第四代氟喹諾酮類藥物的典型代表藥物，廣泛應用于國內外市場。由于可能產生低血糖或高血糖等嚴重乃至致命的不良反應，該藥物從美國和加拿大市場上被撤銷。而中國和其他一些發展中國家仍在使用GAT作為藥物[9]。臨床上報道[10]，它會引起惡心、頭暈、躁動和焦慮。Oladapo Rotimi等[11]研究了10、20、40和80 mg/kg 4個劑量加替沙星對大鼠肝臟氧化應激相關的表觀遺傳學和細胞凋亡相關基因的表達影響，結果表明，10 mg/kg的加替沙星即可誘導肝細胞凋亡和表觀遺傳變化。但是上述研究均未提及肝毒性。GAT在土壤、水和食物中的積累將通過食物鏈增加對人類健康的風險，因此需要評估GAT是否會導致肝毒性。

轉錄組測序(RNA sequencing，RNA-seq)技術可以捕捉不同組織或狀態下的轉錄組動態變化，通過分析不同因素作用下的基因在RNA水平表達的差異，可以將顯著差異表達的基因與某些生物學功能聯系起來，用于檢測早期損傷標志物和分子調控機制的研究[12]。

為了評估GAT暴露是否會產生肝毒性，本文以SPF級昆明小鼠為研究對象，通過檢測小鼠血清肝功能指標變化，采用轉錄組測序技術檢測對照組和GAT給藥組小鼠肝組織的轉錄組動態變化，初步探討加替沙星造成小鼠肝損傷的機制，為深入研究GAT造成人肝損傷的機制提供依據，并為FQs的環境質量標準、藥物監管和風險評估提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試劑

加替沙星(GAT，純度97.2%)由中國食品藥品檢定研究院提供。谷丙轉氨酶(alanine transaminase，ALT)、谷草轉氨酶(aspartate aminotransferase，AST)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，AKP)、肌酐(creatinine，CRE)和甘油三酯(triglyceride，TG)試劑盒，均購自南京建成生物工程研究所。

1.2 實驗動物與處理

32只SPF級雄性昆明小鼠(26~28 g)購自斯貝福(北京)實驗動物科技有限公司，動物許可證號SCXK(京)2019-0010。本研究所涉及的動物實驗由中央民族大學生物與醫學倫理審查委員會批準，動物實驗批準號ECNUC2021002AO。

小鼠適應性飼養3 d后，隨機分為4組，每組各8只。對照組按10 mL/kg灌胃給予雙蒸水。加替沙星低、中、高劑量給藥組分別按25、50、100 mg/kg灌胃給藥，每天1次，連續7 d。飼養環境保持22~24℃的溫度，40%~60%的相對濕度，12 h/12 h晝夜交替。各組小鼠飼養和管理條件相同，每天為小鼠提供干凈的飲用水和食物。給藥7 d后處死小鼠，采血制備血清，取出肝臟并稱取質量，按下式計算肝臟系數。

肝臟系數=肝臟質量/體質量×100%

1.3 血清肝功能指標檢測

采用試劑盒檢測各組小鼠血清中的ALT、AST、AKP、CRE和TG的濃度。

1.4 肝組織轉錄組測序

對照組和中劑量GAT組隨機取3只小鼠的肝組織樣本，用0.9%氯化鈉溶液沖洗殘余血跡，即刻置于含5倍量RNA later試劑的EP管中，隨后置于-20℃冰箱備用。用TRIzol試劑(美國Sigma公司)從肝臟組織中提取總RNA，選擇質量合格的總RNA作為mRNA測序的建庫起始樣品，其質量要求通過Agilent 2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies，Santa Clara，CA，USA)檢測，單次建庫要求RNA總量1μg，濃度≥50 ng/μL，D(260)/D(280)介于1.8~2.2之間。用QUBIT RNA Assay Kit對起始的Total RNA進行準確定量。隨后，反轉錄合成雙鏈cDNA，對這些cDNA進行純化、回收、黏性末端修復，并進行PCR擴增，最后建庫測序。建庫測序由上海美吉生物醫藥科技有限公司完成。

1.5 差異表達基因篩選

將得到的原始測序數據進行過濾篩選，得到高質量的測序數據(clean data)用于后續分析。使用軟件RSEM(http://deweylab.github.io/RSEM/)分別對基因和轉錄本的表達水平進行定量分析，獲得基因的read counts數后，進行樣本間基因的表達差異分析。使用edgeR根據read count進行差異表達水平計算，篩選條件為：FDR＜0.05，|log2FC|≥1。篩選出差異表達基因(differentially expessed gene，DEG)。

1.6 差異表達基因的GO和KEGG富集分析

得到DEG后，為進一步了解差異表達基因的功能，闡述其在分子水平上的作用，通過使用g：Profiler和Goatools的功能注釋工具對差異表達基因進行GO注釋，并采用京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)數據庫進行信號通路富集分析，Bonferroni校正的P＜0.05。

1.7 統計分析

實驗結果數據以±s表示，使用SPSS 20.0進行統計學分析。計量資料采用單因素方差分析法，組間兩兩比較方差齊性時用LSD法，方差不齊時用Dunnettt檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 小鼠肝臟的質量變化

給藥7 d后，各組小鼠的肝臟質量和肝臟系數如圖1所示，可見與對照組比較，高劑量GAT組小鼠的肝臟絕對質量降低(P＜0.05)，低劑量和中劑量GAT組小鼠的肝臟系數降低(P＜0.05)。

圖1 加替沙星對小鼠肝臟質量的影響

2.2 加替沙星對小鼠血清肝功能指標的影響

血清肝功能指標檢測結果如圖2所示，給藥7 d后，與對照組比較，低、中劑量GAT組小鼠血清ALT水平顯著降低(P＜0.05或0.01)；低劑量GAT組小鼠血清AST水平顯著降低(P＜0.01)。小鼠血清AKP和TG水平與對照組比較差異均無統計學意義，且均在正常范圍內。3個劑量GAT組小鼠血清CRE濃度較對照組均顯著降低(P＜0.01)。

圖2 加替沙星對小鼠血清肝功能指標的影響

2.3 差異表達基因的篩選結果

使用TPM方法分析對照組和GAT組小鼠肝組織的差異表達基因，將對照組和中劑量GAT組的數據進行標準化后分析其表達水平，最終篩選出27個差異表達基因，其中有20個表達水平上調，7個下調。為直觀的顯示出差異表達基因，繪制熱圖如圖3所示，顯示出多個基因在兩組中的表達差異。

圖3 對照組和GAT組小鼠肝組織差異表達基因熱圖

與對照組比較，20個表達顯著上調的基因分別 是：Gm47164、Gm45090、Gm48493、Gm42927、Gm48128、Gm48417、9030169P08Rik、Cyp7a1、Igfbp5、Kcnk5、Insig1、Gck、Myc、Fdps、Mvd、Nsdhl、Idi1、Msmo1、Sqle、Cyp51；7個表達顯著下調基因分別是：Nfkbiz、Csf2rb、Csf2rb2、Lepr、Cxcl13、Btg3、Cxcl14。

2.4 差異表達基因的GO功能富集分析

GO注釋結果見圖4，可見27個差異基因在10個生物過程中富集，其中包括免疫過程、多細胞生物過程、多生物過程、生殖過程、定位和發育過程、應激反應、代謝過程、生物調節、細胞過程；在8個細胞組分中富集，包括含蛋白復合物、胞外區、細胞膜、細胞器等；在2個分子功能中富集，包括催化活性和結合。

圖4 GAT給藥組中差異表達基因的GO分析

2.5 差異表達基因的KEGG富集分析

對27個差異表達基因進行KEGG通路分析，結果見圖5，可見表達上調的基因在14條通路中富集，包括脂質代謝、萜類化合物和聚酮化合物的代謝、內分泌系統等；表達下調的基因在8條通路中富集，包括信號轉導、信號分子和相互作用、癌癥總覽等。

圖5 對照組和給藥組差異表達基因KEGG富集通路直方圖

3 討論

自臨床報道FQs的不良反應以來，已有部分藥物被撤市；但是由于部分FQs藥物的不可替代性，仍然應用于臨床。GAT作為FQs典型代表藥物，關于GAT不良反應的研究一直備受關注，其心血管毒性和引起血糖紊亂已被學界廣泛認可，但是GAT引起的肝損傷還未得到證實，其具體機制還需進一步探討。

本研究利用小鼠模型初步評價GAT的肝毒性并采用轉錄組測序技術初步探究其作用機制。結果顯示，100 mg/kg GAT給藥后可引起小鼠肝臟質量降低，25 mg/kg GAT給藥后小鼠血清中ALT、AST和肌酐顯著降低，這提示GAT暴露可造成小鼠肝臟功能的變化。在此基礎上，進一步提取中劑量GAT組肝組織RNA進行高通量轉錄組測序，發現對照組和中劑量GAT組的差異基因數目為27個，其中，表達上調的基因有20個，下調的基因有7個。

細胞色素P450家族成員7A1(cytochrome P450 7A1，CYP7A1)是參與內源性膽固醇及其氧化衍生物(氧甾醇)代謝的細胞色素P450單加氧酶，是膽汁酸生物合成和膽固醇穩態的關鍵調節酶。有研究[13]發現，抑制CYP7A1基因的表達，調節膽汁酸合成、分泌、轉運和吸收，可降低肝內膽汁酸濃度，避免肝臟過度暴露于膽汁酸而發生炎性、纖維化等病變。本研究中，與對照組相比，GAT給藥Cyp7a1顯著上調，提示GAT可能通過膽汁酸合成造成肝內膽汁酸濃度失衡，使肝臟暴露于失衡的膽汁酸環境中而發生損傷。

CYP51(又名羊毛甾醇14α去甲基化酶)是細胞色素C家族成員，將羊毛甾醇轉化成膽固醇，是分布最廣的細胞色素P450成員，是膽固醇代謝相關酶，現已成為降膽固醇藥物研究的熱點。Urlep等[14]研究發現，膽固醇合成缺陷可導致肝臟炎癥和纖維化，實驗敲除CYP51基因，實驗動物出現肝臟腫大，伴有卵圓細胞增生、纖維化和炎癥，但無脂肪變性。且CYP51底物的升高促進了綜合應激反應。本研究中，與對照組相比，GAT給藥后，Cyp51顯著上調，提示GAT可能通過膽固醇合成的異常從而導致小鼠肝組織損傷的發生。

本研究采用高通量測序技術，從基因轉錄水平初步探討了GAT致小鼠肝損傷的機制，實驗結果可為GAT的急性毒理學分析提供基礎數據。鑒于FQs的富集效應和可能引起的肝損傷疾病病例，本研究也有助于建立FQs的藥物監管和風險的理論基礎。此外，本研究可在以下幾個方面作更深入的研究，比如可補充小鼠肝組織的病理變化，直觀地對比GAT給藥造成的組織損傷，以及采用qPCR技術對通路中的顯著變化基因進行進一步驗證，以期為日后研究GAT對人的肝損傷作用及其機制提供理論基礎。