硫化鈉對大鼠經口給藥的毒性和致畸性檢測

夏祺悅，岳茜嵐，豆捷雄，莊思琪，劉科亮*

(四川省疾病預防控制中心，四川 成都 610041)

硫化鈉是一種吸濕性很強的物質，通常我們觀察到的是水合物而不是脫水形式。以現代工藝純化制得的五水合硫化鈉結晶粉末為正交晶型，能在干燥器內長期穩定存在。

硫化鈉在工業領域常用作硫化染料、脫毛劑[1]、蒸煮劑，也是高能量密度的熱化學材料，能改善環境重金屬污染[2]。硫化鈉在醫藥領域也發揮著積極的作用[3]，它是一些口服藥制備工藝中的催化劑，可以制備肌肉松弛藥氯唑沙宗中間體2氨基4氯苯酚[4]，也用于制備抗感染藥物硝呋太爾[5]等。文獻報道口服硫化鈉腸溶片和腸溶膠囊可用于多項疾病的治療及輔助治療[6]。在傳統味精制作工藝中，一般采用硫化鈉作為除鐵劑。由于硫化鈉具有經口暴露的可能性，我們應對其經口毒性引起重視。

目前已有關于硫化鈉及其水合物經靜脈給藥和腹腔給藥的毒性研究，但僅限于急性毒性檢測，經口毒性及系統的安全性評價尚未見報道。本文采用了經口給藥急性毒性試驗、重復給藥毒性試驗和致畸試驗對硫化鈉的安全性進行了初步評價。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

采用SPF級SD大鼠，雌雄各半，由四川省中醫藥科學院實驗動物中心提供，實驗動物生產許可證號為SCXK(川)2018-19。

1.2 主要試劑與設備

1.2.1 受試藥物及處理 五水硫化鈉，由山西省某化工集團股份有限公司提供，純度為96.5%~101.5%，批號為20191012，樣品為白色粉末，易溶于水。試驗時用蒸餾水作溶劑配制成所需濃度。

1.2.2 主要設備 BS800全自動生化分析儀(邁瑞，中國)，XT-2000i型全自動血細胞分析儀(希森美康，日本)，ACL-TOP全自動血凝分析儀(沃芬，美國)，URIT-180尿液分析儀(優利特，中國)。

1.3 試驗方法

1.3.1 急性毒性試驗 采用霍恩法進行試驗[7]，將SD大鼠40只，體質量180~220 g，隨機分為4組，每組10只，雌雄各半。設215、464、1 000、2 150 mg/kg組，按10 mL/kg一次經口灌胃。染毒后觀察兩周內動物的一般狀況、中毒表現及死亡情況。求出半數致死劑量(LD50)值及95%可信區間。

1.3.2 重復給藥毒性試驗 采用灌胃法[8]，選用SD大鼠80只，體質量70～94 g，隨機分成4組，根據大鼠LD50大約1/7劑量設置高劑量為120 mg/㎏，中、低劑量分別為60和30 mg/kg，另設蒸餾水對照組。每天按5 mL/kg經口灌胃給藥，連續給藥90 d，每周記錄體質量、攝食量和食物利用率。試驗結束時，計算總增體質量、總攝食量、總食物利用率，收集動物尿液，檢測尿常規，測定各項血液學血生化指標，解剖動物觀察內臟改變，稱肝臟、腎臟、脾臟、心臟、肺、腦、子宮、卵巢、睪丸、附睪、胸腺和腎上腺等臟器濕質量，計算臟體比，取對照組及高劑量組大鼠多種器官組織作病理學檢查。

1.3.3 致畸試驗 采用常規致畸試驗，操作參照文獻[9]。將雌、雄SD大鼠按2∶1同籠交配，以查見陰栓的當天為妊娠第0天，將查見陰栓的雌鼠隨機分成4組，每組17只，劑量設置同1.3.2。在妊娠第6~15 d，每天按5 mL/kg經口灌胃染毒。于妊娠第0、6、9、12、15天稱體質量，調整灌胃量。于妊娠第20天稱體質量后經麻醉處死動物，記錄總著床數、活胎數、死胎數、吸收胎數和黃體數，稱取子宮連活胎總質量、活胎質量、卵巢質量、胎盤質量并量取胎鼠身長，逐個檢查胎鼠的外觀、將1/2胎鼠放入Bouin'S液中固定兩周檢查內臟，其余胎鼠去內臟后經固定、染色、透明后檢查骨骼。

1.4 統計學方法

應用SPSS 16.0 for Windows軟件。重復給藥毒性試驗數據經方差齊性檢驗，若方差齊，進行方差分析，如P＜0.05則用Dunnett法進行兩兩比較；若方差不齊，改用秩和檢驗，如P＜0.05則用Dunnett'sT3法進行兩兩比較。致畸試驗中，計量資料用±s表示，采用方差分析，計數資料采用χ2檢驗。

2 結果

2.1 急性經口毒性試驗

染毒后215、464 mg/kg組未出現中毒癥狀及死亡，而1 000和2 150 mg/kg組出現共濟失調和呼吸困難等癥狀，部分動物恢復，部分動物染毒5 min內出現死亡，死亡前出現呼吸抑制，死亡后大體解剖發現胃腸脹氣，胃腸道病理鏡檢未見異常。存活動物繼續喂養14 d。觀察期內未見動物死亡。硫化鈉對雌雄SD大鼠急性經口LD50分別為794和926 mg/kg。見表1。

表1 硫化鈉染毒后SD大鼠急性經口毒性試驗結果(n=5)

2.2 重復給藥毒性試驗

受試物以30、60、120 mg/kg經口給予雌雄SD大鼠90 d。試驗期間動物健康狀況良好，體質量持續增長，未見動物死亡。動物血常規和血凝、血生化和電解質的結果如表2和表3。部分指標的改變雖有統計學意義，但無劑量反應關系或無生物學意義。

表2 硫化鈉對SD大鼠末期血液學檢驗結果(±s，n=10)

表2 硫化鈉對SD大鼠末期血液學檢驗結果(±s，n=10)

RBC：紅細胞計數；HGB：血紅蛋白；WBC：白細胞；NEUT：中性粒細胞；LY：淋巴細胞；MONO：單核細胞；EOS：嗜酸性細胞；BAS：嗜堿性細胞；PLT：血小板計數；HCT：紅細胞壓積；APTT：活化部分凝血活酶時間；PT：凝血酶原時間.與對照組比較，*P＜0.05.

性別雄雌劑量/(mg/kg)0 30 60 120 0 30 60 120 RBC/(×1012/L)8.50±0.38 8.57±0.44 8.18±0.31 8.63±0.42 7.92±0.34 8.09±0.85 8.01±0.57 8.22±0.37 HGB/(g/L)157.70±5.36 159.10±5.07 153.40±5.87 158.40±3.10 152.70±7.12 154.00±15.50 150.20±8.27 155.70±5.93 WBC/(×109/L)8.57±1.26 7.66±1.73 9.78±2.36 6.16±1.60*3.63±0.96 3.17±1.11 5.12±1.67 4.07±0.95 NEUT/%17.63±7.76 22.62±11.02 14.80±3.81 23.50±4.47 11.49±3.89 19.88±7.98*11.70±6.02 15.53±5.64 LY/%73.59±8.85 67.04±10.43 76.78±4.45 66.12±4.36 79.24±5.23 69.81±7.21*80.11±6.55 74.62±8.03 MONO/%6.46±2.05 7.14±1.70 6.21±1.56 6.15±1.46 5.60±1.43 7.13±2.35 5.16±1.73 6.21±1.26性別雄雌劑量/(mg/kg)0 30 60 120 0 30 60 120 EOS/%2.42±0.49 3.33±0.95 2.31±0.63 4.34±1.82*3.78±0.77 3.27±1.33 3.15±0.60 3.80±2.18 BAS/%0.10±0.07 0.07±0.05 0.10±0.05 0.09±0.08 0.09±0.11 0.11±0.16 0.08±0.10 0.04±0.00 PLT/(×109/L)1026.90±71.213 998.80±122.71 977.30±132.88 1073.80±142.05 960.20±58.74 1039.10±158.37 1024.00±99.46 967.70±114.10 HCT/(L/L)0.44±0.02 0.44±0.01 0.43±0.01 0.44±0.01 0.44±0.02 0.45±0.04 0.43±0.02 0.44±0.02 APTT/s 19.71±0.58 19.21±1.34 22.42±1.28*20.18±2.34 19.95±1.88 18.52±2.97 21.03±1.62 21.11±1.41 PT/s 11.99±0.91 11.77±0.58 12.94±1.29 12.39±1.03 9.76±0.56 9.89±0.47 9.45±0.59 9.41±0.29

表3 硫化鈉染毒后SD大鼠末期血生化及電解質檢驗結果(±s，n=10)

表3 硫化鈉染毒后SD大鼠末期血生化及電解質檢驗結果(±s，n=10)

TP：總蛋白；ALB：白蛋白；ALT：谷丙轉氨酶；AST：谷草轉氨酶；ALP：堿性磷酸酶；GGT：谷氨酰轉肽酶；BUN：尿素氮；CREA：肌酐；TC：總膽固醇；TG：甘油三酯；GLU：血糖；K：血清鉀；Na：血清鈉；Cl：血清氯.與對照組比較，*表示P＜0.05.

性別雄雌劑量(mg/kg)0 30 60 120 0 30 60 120 TP/(g/L)54.03±1.43 53.51±1.75 52.99±1.88 53.86±1.90 59.80±3.61 58.87±4.72 57.32±2.28 59.62±4.11 ALB/(g/L)29.85±0.82 29.68±0.76 29.50±1.21 29.97±1.08 33.76±2.04 33.39±2.35 32.63±1.33 33.53±1.80 ALT/(U/L)57.12±27.46 64.24±52.13 49.57±11.78 60.54±20.69 23.40±4.14 27.58±6.19 23.34±4.30 25.03±8.89 AST/(U/L)175.46±61.17 198.72±81.03 161.25±33.39 223.13±59.93 117.51±26.15 141.54±50.48 108.52±21.96 133.29±81.66 ALP/(U/L)96.31±15.38 99.85±12.71 105.03±16.36 99.70±10.12 69.74±14.64 64.30±16.47 67.02±14.67 63.82±18.91 GGT/(U/L)0.40±0.16 0.38±0.19 0.42±0.23 0.34±0.13 0.33±0.24 0.41±0.34 0.39±0.24 0.43±0.25 BUN/(mmol/L)6.78±0.70 7.09±0.48 6.63±0.86 7.31±0.47 8.62±1.10 9.53±0.78 8.82±1.18 9.26±0.90性別雄雌劑量(mg/kg)0 30 60 120 0 30 60 120 CREA/(μmol/L)63.21±11.27 66.88±5.50 58.26±6.01 70.64±12.19 61.97±7.20 57.41±11.90 60.63±7.96 59.87±6.48 TC/(mmol/L)1.35±0.28 1.39±0.19 1.25±0.32 1.40±0.21 1.90±0.22 1.80±0.40 1.72±0.30 1.90±0.37 TG/(mmol/L)0.57±0.24 0.56±0.23 0.60±0.21 0.56±0.17 0.63±0.16 0.73±0.35 0.52±0.11 0.49±0.09 GLU/(mmol/L)8.13±0.95 8.03±0.41 9.33±1.73 9.03±1.51 8.84±0.91 7.85±1.22 9.71±1.34 8.93±0.90 K/(mmol/L)5.18±0.35 5.26±0.24 5.08±0.32 5.29±0.36 4.91±0.24 5.21±0.36 4.87±0.36 5.20±0.35 Na/(mmol/L)144.22±0.81 144.56±0.55 144.40±0.19 144.17±1.07 147.57±2.50 145.35±2.60 146.17±0.97 145.50±0.96 Cl/(mmol/L)104.49±1.24 105.82±0.99*105.29±1.04 106.01±1.47*107.73±2.45 107.12±1.75 106.91±0.83 107.27±1.01

重復給藥毒性試驗中，解剖大體觀察發現硫化鈉120 mg/kg劑量組大鼠腸道出現點狀出血灶。病理鏡檢結果顯示，120 mg/kg劑量組大鼠消化道觀察到主要以小腸黏膜壞死脫落和大腸腸壁各層炎細胞浸潤為主要特征的異常改變(見圖1)。其他器官組織僅見動物自發病變。在本試驗條件下，該受試物對SD大鼠的未觀察到有害作用劑量(no-observed adverse effect level，NOAEL)為60 mg/kg。

2.3 致畸試驗

2.3.1 硫化鈉對SD孕鼠體質量的影響 試驗期間，孕鼠未出現母體毒性及死亡。由表4可見，硫化鈉3個劑量組對孕鼠各時點體質量的影響與對照組間的差異均無統計學意義(P＞0.05)。

2.3.2 硫化鈉對SD大鼠胎仔的影響 與對照組比較，硫化鈉120 mg/㎏劑量組17只受孕大鼠中，3只孕鼠共發現4只死胎，死胎百分率顯著增加(P＜0.05)；有1只受孕大鼠所產17只仔鼠中，7只出現短肢，外觀畸形窩發生率顯著增加(P＜0.05)。未見受試物對胎仔骨骼及內臟發育產生不良影響。見表5。

圖1 120 mg/kg硫化鈉對消化道的病理學損傷(×100倍)

表4 硫化鈉對SD孕鼠體質量的影響(±s，n=17)

表4 硫化鈉對SD孕鼠體質量的影響(±s，n=17)

劑量/(mg/kg)對照組硫化鈉30 60 120妊娠天數第0天297.4±17.0 293.2±17.8 283.6±19.7 286.4±18.5第6天337.7±20.6 329.2±17.2 325.9±22.5 326.3±20.6第9天357.1±25.1 345.2±18.9 341.9±22.1 339.1±19.1第12天375.6±31.0 361.0±23.5 360.1±26.1 358.8±19.7第15天397.5±33.6 388.6±30.9 379.3±28.4 382.6±20.3第20天494.0±43.5 469.4±47.1 461.5±43.0 463.9±36.5

表5 硫化鈉對SD孕鼠胎仔的影響(±s)

表5 硫化鈉對SD孕鼠胎仔的影響(±s)

與對照組比較，*P＜0.05.

劑量/(mg/kg)對照組硫化鈉30 60 120交配鼠數/只20 19 20 20活胎數/只254 223 222 222窩平均活胎數/只14.9±2.5 13.1±4.1 13.1±4.1 13.1±4.0吸收胎數/只3433死胎數/只0014死胎百分率/%0.00 0.00 0.44 1.75*短肢發生數/個0007短肢發生率/%000 3.15外觀畸形窩發生數/個0001外觀畸形窩發生率/%000 5.88*子宮連胎總質量/g 103.0±16.4 89.0±26.0 91.6±29.3 93.2±28.5胎仔平均體質量/g 4.50±0.54 4.49±0.15 4.47±0.22 4.81±0.52胎仔平均身長/cm 4.10±0.14 4.09±0.12 4.09±0.05 4.14±0.19

3 討論

本研究急性經口毒性試驗中，大鼠染毒后出現共濟失調和呼吸困難等癥狀，并于染毒后幾分鐘內死亡，死亡前有呼吸抑制，死亡后大體解剖發現腸道有脹氣，胃腸道病理鏡下檢查未見異常。由于大鼠出現了呼吸困難，呼吸抑制等作用，可能因為神經系統或呼吸系統出現了急性損傷造成了死亡，應在今后的研究中注意對腦和肺部急性損傷進行大體觀察和病理鏡檢。

根據文獻[10]報道，我們推測口服硫化鈉后在腸道經硫酸鹽還原菌發酵生成大量硫化氫，過高濃度的硫化氫無法在腸道內通過酶途徑等解毒過程清除，能引起硫化氫中毒，對皮膚黏膜有腐蝕作用，這可能是硫化鈉對腸道黏膜造成損傷的原因。同時它會參與體內炎癥反應，引起慢性腸道炎癥性疾病、結直腸癌等相關疾病。本研究中重復給予硫化鈉90 d后，120 mg/kg劑量組能引起明顯腸道炎性反應，結腸的炎性反應可能與過量硫化氫在結腸產生的多種效應有關，除了抑制細胞的呼吸功能，促凋亡作用，硫化氫還可降低結腸上皮細胞對丁酸鹽的氧化作用，導致黏膜通透性增加，腸道屏障功能受損[11]。

硫化鈉是常見的硫化氫供體[12]，其致畸試驗鮮見報道，經口研究更少。有文獻報道硫化氫對斑馬魚胚胎和仔魚均有劑量依賴性的發育毒性和畸形性[13]。另有研究[14]發現，硫化氫在較低的濃度短時間釋放，對人精子具有毒性，會降低人精子活力。在本研究的致畸試驗中我們經口給予硫化氫供體硫化鈉，發現120 mg/kg劑量組中死胎百分率顯著增加，外觀畸形窩發生率顯著增加，提示硫化鈉可能有胚胎毒性和外觀致畸毒性。我們觀察到120 mg/kg硫化鈉對孕鼠進食量影響有降低作用，但差異無統計學意義，并且對大鼠腸道黏膜造成了損傷，可能影響動物營養物質吸收，從而影響仔鼠發育。致畸試驗的結果雖然有統計學意義，但是17只孕鼠中僅1只孕鼠的胎仔存在外觀畸形，不足以判定受試物的致畸性。試驗結果未出現明顯毒性，這可能與高劑量組(120 mg/kg)設計劑量較低有關，今后尚需提高劑量重復試驗確定結果。高劑量應保證重復給藥毒性試驗大鼠出現明顯中毒反應及少量死亡；致畸試驗大鼠出現明顯胚胎毒性或輕微的母體毒性反應。

所以，關于硫化鈉的安全性研究，以及它的生理和病理作用機制仍有待進一步研究明確。