褪黑素在帕金森病治療中的研究進展

尹亞萍，王 宇，田雨陽，馬 焜*，李百祥*

(哈爾濱醫科大學公共衛生學院衛生毒理學教研室，黑龍江 哈爾濱 150081)

帕金森病(Parkinson's disease，PD)是全球第二常見的神經退行性疾病，我國65歲以上中老年人的患病率已高達2%，發病率僅次于阿爾茲海默癥，且患病率隨年齡的增加呈指數增長。PD的病理改變為黑質(substantia nigra，SN)致密部的多巴胺能神經元發生退行性病變，多巴胺(dopamine，DA)水平降低，同時伴隨細胞內路易小體形成。PD以運動遲緩、靜息性震顫、肌僵直和平衡障礙(姿勢不穩)為典型臨床表現，90%的患者還經歷了抑郁、幻覺、睡眠障礙等非運動癥狀[1]。PD的病因尚未完全明確，年齡因素、遺傳因素、環境污染和氧化應激等因素均可能參與多巴胺能神經元的變性死亡過程，增加PD的發病風險。褪黑素(melatonine，MT)是人體內重要的抗氧化物，被認為和PD的發生發展密切相關。Lin等[2]發現，隨著年齡的增長，成年人血清MT無明顯變化，但中老年人夜間的血清和腦脊液MT水平在60歲開始下降，直到70歲時下降到最低，推測MT的減少可能是PD發病的重要因素。近年來已有許多關于褪黑素在PD治療和控制方面的臨床研究[3]。

1 帕金森病的病理機制

1.1 環境及遺傳因素

流行病學調查結果發現，90%的散發型PD是僅由環境因素或環境因素和遺傳因素共同影響的。研究表明，多種環境因素與PD的發病相關，如1-甲基-4-苯基-1,2,3,6四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine，MPTP)、除 草 劑、殺蟲劑、顱腦損傷、β受體阻滯劑等均可導致PD。PD病人中僅5%~10%有家族史，其家族中的PD發病具有明顯的聚集傾向，病人的親屬或者后代PD的發病率較無PD家族史的人群發病率更高。在這些家族性PD患者體內共鑒定出2個常染色體顯性遺傳基因：α-突觸蛋白(α-synuclein，α-syn)基因SNCA，富含亮氨酸的重復激酶2(leucine-rich repeat kinase 2，LRRK2)。3個常染色體隱性PD相關基因：parkin，PINK1和DJ-1。其中LRRK2突變是遲發性PD最常見的遺傳病因，占所有PD患者的1%~2%，parkin是早發性PD(30歲以前)的主要病因，而當前重點研究的GBA和LRRK2兩個基因，則與典型晚發PD有關[4]。

1.2 氧化應激反應

隨著機體正常的老年化，多巴胺能神經元對氧化應激反應中的活性氧(reactive oxygen species，ROS)敏感性增加。PD患者腦黑質內谷胱甘肽(glutathione，GSH)和鐵蛋白含量降低，抗氧化酶活性降低，自由基清除能力下降。目前認為PD患者腦內多巴胺、神經黑色素和鐵的代謝異常、線粒體功能障礙等均可引起腦內自由基的過量蓄積。PD患者腦內多巴胺轉運體和囊泡轉運體存在異常，多巴胺蓄積在突觸間隙，在單胺氧化酶的作用下生成過氧化氫，其中一部分被抗氧化系統清除，另一部分在神經黑素(抗壞血酸)的作用下和鐵發生Fenton反應生成毒性更強的羥自由基(·OH)，進而將DA羥基化生成6-羥基多巴胺(6-hydroxydopamine，6-OHDA)等[5]。內源性和外源性因素又會造成線粒體復合物Ⅰ(又稱為NADH-Q氧化還原酶)損傷，破壞線粒體呼吸鏈，使產生的ROS增加。氧化應激除引起線粒體功能障礙外，還能直接損傷細胞生物大分子如蛋白質、脂質和核酸，導致細胞內抗氧化物酶水平降低，同時生成大量的丙二醛(malondialdehyde，MDA)，破壞細胞膜，進而導致細胞凋亡的發生[6]。

1.3 線粒體功能障礙

線粒體是細胞能量來源的工廠。一項PD患者的解剖結果顯示，其腦組織中線粒體復合物Ⅰ水平降低了35%[7]。當線粒體功能出現異常，如線粒體復合物活性降低、鈣離子紊亂、跨膜電位崩潰等均可引起細胞能量代謝障礙，ATP合成數量明顯下降，細胞膜內外離子因能量供應不足，引起線粒體膜電位降低，Ca2+急劇內流，激活磷脂酶分解膜磷脂，耗竭細胞內ATP并導致DNA斷裂。同時Ca2+還能作為細胞凋亡第二信使激活線粒體細胞凋亡通路，調節鈣蛋白酶、鈣調神經磷酸酶對α-syn的作用。線粒體復合物活性降低還會產生更多的自由基，自由基可與生物膜上的脂肪酸(如心磷脂)發生氧化還原反應，過多的自由基聚集時可氧化線粒體通透性轉換孔(mitochondrial permeablity transition pore，mPTP)上的ADP/ATP載體，導致mPTP開放，誘導細胞色素C(cytochrome C，Cyt C)釋放，使電子傳遞鏈在Cyt C氧化酶處受阻，形成電子漏，產生更多的ROS。mPTP開放還能引起線粒體膜通透性升高，跨膜電位崩潰，許多大分子物質如Cyt C、凋亡誘導因子(apoptosisinducing factor，AIF)等細胞凋亡因子伴隨著Ca2+排到胞質。在胞質內ATP環境下，Cyt C與凋亡蛋白酶激活因子1、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9結合形成凋亡小體，激活caspase-3等細胞凋亡下游通路，引起線粒體腫脹和細胞凋亡。此外，parkin、PINK1、DJ-1等基因異常也會導致線粒體自噬和再生障礙，誘發多巴胺能神經細胞凋亡[8]。

1.4 神經炎性反應

PD神經炎癥的主要表現為小膠質細胞和星形膠質細胞被反復激活，通過旁分泌途徑損傷神經元[9]。激活的小膠質細胞能釋放多種炎癥介質和趨化因子，如白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、IL-6、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、干擾素-β、NO、前列腺素E2等，誘導多巴胺能神經元出現神經炎癥損傷[9]；此外，小膠質細胞還能通過調節NADPH氧化酶向胞外釋放超氧化物，誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)、環氧化物合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)等的合成，導致多巴胺能神經元變性壞死，其產生的炎癥因子可以影響星形膠質細胞正常功能，抑制星形膠質細胞攝取突觸間隙的谷氨酸等興奮性神經遞質，降低神經營養因子表達，促進興奮性氨基酸的神經毒性，引起多巴胺系統的功能性損傷[10]。研究表明，PD患者神經炎癥的發生可能與血腦屏障通透性的升高、外周淋巴細胞(CD4+、CD8+)的過度激活有關[11]。

1.5 毒性蛋白堆積

在PD患者體內，異常聚集的α-syn會促進多巴胺能神經元的變性壞死和紋狀體路易小體的產生，并伴發α-syn的生理缺陷。研究表明，α-syn可通過調節蛋白磷酸酶2或與伴侶蛋白相互作用參與酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase，TH)脫磷酸化，病理情況下引起DA生成減少[12]。α-syn選擇性的抑制磷脂酶D2，影響囊泡內多巴胺水平和突觸小泡完整性，抑制紋狀體囊泡和突觸對多巴胺的合成、儲存和重吸收。α-syn還能引起內質網、高爾基體應激，溶酶體、蛋白酶體活性受損，從而導致細胞新陳代謝紊亂。此外，α-syn表達升高還會增加氧化應激壓力，破壞Ca2+穩態，誘導鈣蛋白酶激活炎癥反應。有報道指出，α-syn進入線粒體后，不僅可以與呼吸鏈中的Cyt C氧化酶結合影響線粒體呼吸過程，還可與線粒體膜結合抑制線粒體的融合導致線粒體斷裂[13]。

Mazurskyy等[14]提出“雙重打擊”假設，PD開始于嗅覺黏膜或腸道直接接觸毒素或病原體，嗅球或胃腸道內錯誤折疊的α-syn可能會形成具有“朊病毒樣”傳遞性的包裹體，沿著迷走神經傳入中腦神經系統，形成PD腦內神經系統的功能紊亂。

2 MT輔助治療PD患者的臨床研究進展

MT是一種主要在松果體細胞合成并釋放的神經激素，是體內的強自由基清除劑和抗氧化劑，MT的自由基清除能力是GSH的4倍，甘露醇的14倍。MT被廣泛應用于抗炎、抗氧化、鎮靜和晝夜節律的調節，近年來還被應用于癌癥的治療。MT及其產物均能直接或間接清除活性氧和活性氮，間接地激活抗氧化酶和抗氧化非酶分子。MT還能螯合某些過渡金屬(如Fe2+和Mn2+)，減少具有致命毒性的羥基自由基的形成，從而降低氧化應激。研究表明，MT對6-OHDA、β-淀粉樣蛋白、MPTP/MPP+等引起的毒性損傷均可發揮神經保護作用，并已被認為是一種良好的神經退行性疾病保護劑。

2.1 MT抗氧化作用

MT具有高親脂性和部分親水性，有高度彌散穿透能力，從而在細胞膜、細胞質和細胞核中均能發揮抗氧化作用。MT主要通過直接清除自由基和調節抗氧化酶活性發揮抗氧化作用，以保護細胞DNA、膜脂質、胞漿蛋白等生物大分子免受氧化損害。研究表明，在6-OHDA誘導的PD大鼠模型中，對大鼠單側鼻內注射30 mg/kg MT，能有效保護SN多巴胺能神經元免受氧化應激損傷，且使ROS和MDA水平明顯降低、過氧化氫酶、GSH及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)含量顯著上升[15]。在另一項應用MPTP斑馬魚PD模型中，MT已被證實還可以通過降低GSSG/GSH比值和維持抗氧化酶的表達發揮抗氧化作用[16]。MT可直接與其特異性受體MT1和MT2受體結合，誘導一型血紅素氧化酶、醌氧化還原酶和谷胱甘肽-S-轉移酶、谷氨酸半胱氨酸連接酶及環氧化物水解酶(epoxide hydrolase，EH)等抗氧化應激蛋白的轉錄，提高細胞抗氧化應激能力，減少細胞內ROS的產生。同時，將MT與左旋多巴(levodopa，L-DOPA)聯合應用，可以延長小鼠體內L-DOPA的有效期，并進一步增強了左旋多巴對運動的反應，并保護外源性多巴胺前體不受自身氧化，且副作用較小，無明顯毒性[17]。

2.2 MT恢復線粒體功能

MT可在神經細胞線粒體內保持較高濃度，并作為線粒體內的專性抗氧化劑。早在1900年Shapira就發現，PD患者黑質細胞復合物I活性降低明顯，而MT可以通過多種抗氧化途徑清除氧化磷酸化過程產生的自由基，保護復合物I和IV，增加ATP的合成[18]。MT通過保護心磷脂(cardiolipin，CL)不被氧化，能同時抑制Ca2+/過氧化叔丁醇誘導的CL氧化和mPTP開放過程，維持線粒體跨膜電位，阻礙甲基苯丙胺(methamphetamine，METH)通過激活鈣蛋白酶誘導人神經母細胞瘤SH-SY5Y細胞凋亡[19]。MT不僅可以恢復線粒體呼吸酶的活性，還可以調節線粒體融合和裂變過程。MT作用于線粒體特異性蛋白，并激活解耦連蛋白耗散質子跨越線粒體內膜的梯度以適度減少內膜潛力，可使膜間質子回到基質，降低線粒體膜電位，顯著增加復合物Ⅰ和Ⅲ的活性，加速電子傳遞鏈中的電子傳輸，減少電子泄露和ROS的產生，這稱為MT降低膜電位形成“自由基回避效應”。MT還能通過激活MAPK通路、抑制線粒體裂變蛋白1、動力相關蛋白1(dynamin-related protein 1，Drp1)的活性，調控線粒體的吞噬和發生。在用魚藤酮處理SH-SY5Y細胞誘導的PD模型中，Zhou等發現MT不僅調節了線粒體的跨膜電位，上調CytC蛋白水平，還調節了Drp1的表達，抑制Drp1誘導的線粒體碎片化[20]。Diaz-Casado等的研究表明，MT可以改善線粒體相關基因的表達，在斑馬魚胚胎PD模型中，恢復了因parkin/PINK1/DJ-1/MUL1網絡異常造成的線粒體損傷[21]。

2.3 MT抗神經炎癥

研究發現，MT在10和100 mol/L濃度處能抑制MPTP誘導大鼠星形細胞瘤細胞(C6)神經炎癥過程中TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表達[22]。MT的預處理可顯著抑制MPTP誘導的iNOS mRNA的過表達，降低了星形膠質細胞中亞硝酸鹽的釋放和NO的神經毒性作用，減少多巴胺能神經元的凋亡，預防神經炎癥的發生。最新的研究表明，MT還能拮抗METH誘導的血腦屏障的破壞，保護反應性神經膠質細胞。MT能降低MPTP小鼠COX-2表達，從而抑制前列腺素E2的合成，阻礙其介導的神經退行性病變，MT的這些保護作用同樣也在MPTP誘導的C6細胞的體外實驗中被發現[23]。MT還能減弱膠質纖維酸性蛋白的表達，抑制星形膠質細胞的增生。Niranjan和他的團隊還驗證了MT抑制MPTP引起的神經炎癥的機制，MT通過抑制p38絲裂原活化蛋白激酶表達和核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)信號通路的激活，阻礙NF-κB轉運到細胞核激活神經炎癥反應[22]。

2.4 MT抑制α-syn的毒性作用

MT除了抗炎抗氧化外，還能通過影響α-syn的表達、聚集和直接結合抑制路易小體的形成，以改善多巴胺能神經元的生存環境。MT能顯著降低甲基苯丙胺引起的腦內α-syn過表達，尤其是在小鼠腦內黑質部分，MT降低了77%的α-syn表達水平。有研究指出，鈣蛋白酶通過切割α-syn的羧基末端片段降低其溶解性，促進α-syn的原纖維化和聚集，Schlachetzki還提出MPTP小鼠腦內α-syn的積累可能是通過增加鈣蛋白酶活性實現的[24]。MT能螯合游離的鈣蛋白酶，拮抗鈣蛋白酶與α-syn結合的促聚集作用，降低α-syn的毒性，提示MT可以直接和α-syn結合抑制其毒性作用。Chang等發現MT能拮抗海人藻酸(kainic acid，KA)促進α-syn的聚集作用，而KA能在不改變αsyn單體水平的情況下，通過抑制泛素化加速α-syn聚集，提示MT可能通過促進α-syn泛素化抑制其聚集，發揮神經保護作用[25]。

2.5 MT抗細胞凋亡作用

MT能激活神經細胞的生存信號級聯通路，抑制多巴胺能神經元的凋亡。MT通過MT1/MT2信號轉導和鈣調蛋白-LOX途徑，將Bcl-2重新定位到線粒體中，螯合促凋亡蛋白Bax，抑制其激活線粒體凋亡通路。此外，MT還可以分別上調Bcl-2、下調Bax基因的表達，降低Bax/Bcl-2比值，預防Bax從胞質轉運到線粒體，抑制mPTP開放和Cyt C、AIF等促凋亡物質釋放引起的細胞凋亡[26]。

2.6 MT抗細胞自噬“雙刃劍”作用

細胞自噬(autophagy)是細胞代謝過程中的衰老細胞器和異常蛋白質等成分降解的過程，一些損壞的蛋白或細胞器被自噬小泡包裹后，在溶酶體中進行降解和消除，誘導的自噬可以清除損傷的線粒體和ROS損傷的蛋白，減輕后續的級聯反應，抑制凋亡，有利于維持細胞穩態。Nopparat等[27]在METH誘導的人神經母細胞瘤SK-N-SH細胞PD模型中，發現MT拮抗了METH誘導的c-Jun氨基末端激酶磷酸化激活，抑制Bcl-2/Beclin-1的解離，阻礙自噬相關蛋白Beclin-1相關的磷脂酰3-激酶活性，防止細胞因過度自噬造成的凋亡或壞死。這說明病理狀態下，細胞自噬被激活或抑制，細胞內出現過低自噬、自噬不足和過度自噬均引起或加重組織損傷，線粒體損傷，細胞內蓄積ROS觸發細胞凋亡。在相同的SK-N-SH細胞模型，Kongsuphol等[28]發現MT預處理能阻止METH滅活哺乳動物雷帕毒素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)和去磷酸化真核細胞翻譯起始因子4E結合蛋白1，增強mTOR信號通路，抑制細胞自噬死亡。Su等[29]發現，MT還能通過抑制細胞周期素依賴蛋白激酶5信號級聯，降低自噬標志物微管相關蛋白1輕鏈3B-II水平，逆轉MPTP引起的細胞自噬。此外，MT還能通過降低細胞自噬通量和提高神經營養因子如腦源性神經營養因子和神經生長因子含量，間接調控多巴胺能神經元的凋亡。

2.7 MT改善睡眠障礙作用

目前研究表明，PD患者出現運動障礙時常伴隨嗜睡、快速眼動睡眠行為障礙(rapid eye movement sleep behavior disorder，RBD)及失眠，這可能是由于中腦邊緣環路中多巴胺能神經元及與睡眠相關神經元變性所致，是PD患者一種非運動癥狀，且在患者認知功能降低和抑郁狀態的共同作用下，加速了PD患者喪失日常活動能力的進程。已有研究表明，RBD與PD的發生發展具有一定相關性，并可能成為PD的前驅癥狀，RBD主要特點是夜夢較多及骨骼肌張力增高，以α-突觸核蛋白的組織病理學改變為特征，研究表明，約60%的帕金森病患者伴有RBD。已有臨床證據表明，MT對帕金森的RBD有一定治療效果，MT通過恢復快速眼動睡眠期骨骼肌失馳緩現象而改善快速眼動睡眠期間伴隨的夢境及肢體活動情況，因此也被推薦為RBD的治療藥物。Kunz等[3]在臨床研究中發現，在使用MT每天睡前30 min服用2 mg緩釋劑后，患者DA轉運體增加，快速眼動睡眠行為障礙消失。已有研究表明MT會改善帕金森患者的RBD癥狀[30]。但也有研究認為低劑量MT對PD患者的RBD癥狀無效[31]。MT不能使黑質紋狀體通路中的多巴胺能神經元再生，但有希望延緩甚至終止PD的病理進展。外源性MT對于PD患者的夜間睡眠障礙、白日嗜睡、焦慮等均有較好的治療效果，MT還可改善PD患者的抑郁、譫妄和部分運動癥狀。對于這些結論的差異，可能是由評估RBD嚴重程度的終點不同所造成的。在給予MT或安慰劑的臨床隨訪中，由于患者或其床伴對RBD發作情況的記錄具有很強的主觀性，導致結果的準確性存在爭議。

在大多數PD動物實驗中，MT表現了良好的運動調節和神經保護作用。但在PD患者臨床試驗中，外源性MT對神經保護、認知和運動益處的效果往往令人失望，盡管PD患者的主觀睡眠質量得到顯著改善，但MT并未改善患者的運動功能障礙，亦無法改變疾病進程，這可能是由于目前實驗研究樣本量過小，或者與應用的MT劑量過低有關。人體內MT水平晝夜波動較大，且不同部位存在差異分布。因此，MT臨床應用的劑量和應用的時機還需要更多的臨床實驗研究來驗證。

3 小結

褪黑素是人體內天然存在的抗氧化活性物質，大量的體內、體外實驗表明褪黑素對于帕金森病具有較好的預防和治療作用。臨床上褪黑素已被應用于治療帕金森病的非運動癥狀。褪黑素補充劑對帕金森病的氧化應激、神經炎癥以及細胞凋亡等方面均有較強的拮抗作用。這顯示出褪黑素具有一定的神經保護作用，具有改善PD癥狀的潛能。雖然PD病因及發病機制十分復雜，MT在PD中的作用也尚未完全明確，但褪黑素在一定程度上有益于帕金森病受損的DA能神經元的恢復。這將對未來研究褪黑素臨床治療帕金森病具有重要的理論意義和實際意義，為防治帕金森病和研制拮抗神經損傷的藥劑提供新的理論依據。