不同擬桿菌的定殖對(duì)偽無(wú)菌小鼠血清生化指標(biāo)和短鏈脂肪酸的影響

鄭志天，程教擘，鐘亞?wèn)|，陳蘇明，黃同文，孫永敢，胡婕倫

（南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中加食品科學(xué)技術(shù)聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室（南昌），江西 南昌 330047）

腸道菌群是指所有寄居在人體腸道內(nèi)的微生物群落，近年來(lái)的研究逐漸揭示了腸道菌群的結(jié)構(gòu)組成以及腸道菌群失衡對(duì)宿主整體健康的影響[1-3]。在輔助宿主消化及營(yíng)養(yǎng)吸收、維持腸道發(fā)育和預(yù)防疾病等方面腸道菌群起著至關(guān)重要的作用[4-8]，這促使人們探索針對(duì)腸道菌群的干預(yù)措施，其中選擇性增加有益于人類(lèi)健康的腸道微生物是一個(gè)新的研究熱點(diǎn)。目前改善腸道菌群主要分為兩個(gè)途徑，一是直接通過(guò)進(jìn)食或灌腸移殖的方式增加腸道益生菌，二是通過(guò)攝入不可消化的膳食纖維等益生元選擇性刺激少數(shù)有益菌調(diào)節(jié)腸道菌群從而改善宿主健康[9-12]。腸道菌群數(shù)量龐大、種類(lèi)豐富，與宿主的交互關(guān)系錯(cuò)綜復(fù)雜。對(duì)具體腸道菌特性的研究，有助于達(dá)成腸道菌群干預(yù)措施效益最優(yōu)化的目的。

腸道菌群主要由擬桿菌門(mén)和厚壁菌門(mén)組成，占腸道菌群總量的90%以上[13]。擬桿菌可賦予宿主多種益處，其中包括發(fā)酵宿主不易消化的多糖以提供能量。擬桿菌屬是已知腸道菌群中多糖利用位點(diǎn)最多的一類(lèi)菌，它們中約有20%基因組用于多種多糖的轉(zhuǎn)運(yùn)和分解以及這些過(guò)程的調(diào)控[14]，其能發(fā)酵難消化的大分子碳水化合物為宿主提供能量并轉(zhuǎn)化為短鏈脂肪酸。短鏈脂肪酸在腸道內(nèi)不僅可作為腸黏膜細(xì)胞的主要能量來(lái)源和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，還可以減少促炎因子的生成，降低結(jié)腸炎癥的發(fā)生，這直接影響了腸道微生物生態(tài)和整體腸道健康[15-16]。擬桿菌這種優(yōu)勢(shì)菌可通過(guò)自身的定殖直接抑制其他有害菌群的腸道黏附和生長(zhǎng)，并且在宿主腸道菌群失調(diào)時(shí)重新引入該菌可以盡快促使腸道微生態(tài)恢復(fù)至平衡狀態(tài)[17]。無(wú)菌小鼠是用于研究特定腸道微生物代謝及其與宿主相互作用的經(jīng)典媒介[18]，然而其價(jià)格昂貴，難以普及以應(yīng)對(duì)日益增加的腸道菌群相關(guān)研究。此外，無(wú)菌小鼠淋巴系統(tǒng)發(fā)育不成熟，在免疫等方面與常規(guī)小鼠差異較大[19-20]。通過(guò)灌胃廣譜抗生素混合物剔除絕大多數(shù)腸道菌群的方法建立偽無(wú)菌小鼠動(dòng)物模型，該模型小鼠生理變化與正常小鼠基本無(wú)顯著性差異，且其研究結(jié)果往往與無(wú)菌小鼠動(dòng)物模型保持一致[21-22]。因此，開(kāi)發(fā)這種易獲得、低成本、免疫系統(tǒng)發(fā)育更完善的無(wú)菌小鼠替代模型對(duì)于腸道菌群研究有著重要意義。本研究通過(guò)灌胃混合廣譜抗生素建立偽無(wú)菌小鼠模型，將多種耐酸腸道擬桿菌分別定殖于偽無(wú)菌小鼠腸道中，構(gòu)建簡(jiǎn)化的腸道菌群結(jié)構(gòu)模型，使單一擬桿菌株成為小鼠體內(nèi)的主要優(yōu)勢(shì)菌，以便觀察其對(duì)小鼠健康及代謝的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Bacteroides koreensis YS-aM39、Bacteroides thetaiotaomicron JCM 5827、Bacteroides ovatus JCM 5824、Bacteroides xylanisolvens XB1A、Bacteroides salyersiae JCM 12988、Bacteroides vulgatus ATCC 8482：由南昌大學(xué)中加食品科學(xué)技術(shù)聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室從健康人體糞便中篩選所得；鹽酸萬(wàn)古霉素（美國(guó)藥典級(jí)別）、硫酸新霉素（美國(guó)藥典級(jí)別）、氨芐青霉素（純度96%）、甲硝唑（純度≥99%）：北京索萊寶科技有限公司；腦心浸液肉湯（brain heart infusion broth，BHI）固體培養(yǎng)基、BHI液體培養(yǎng)基：青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；糞便基因組DNA提取試劑盒、熒光定量預(yù)混試劑盒：天根生化科技有限公司；乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸、2-乙基丁酸（純度均≥99.5%，分析純）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；實(shí)驗(yàn)室用水為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

電子分析天平（XS205）、pH 計(jì)（FE28）：上海梅特勒-托利多儀器公司；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（Sorvall ST16R）、超微量分光光度計(jì)（NanoDrop2000）、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time quantitative polymerase chain reaction，qPCR）擴(kuò)增儀（ABI 7900HT）：賽默飛世爾科技公司；PCR熱循環(huán)儀（T100TM）：伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器（YXQ-100SII）：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；比濁儀：上海德記行科技發(fā)展有限公司；厭氧手套箱（COY-8300600）：美國(guó) COY公司；生物安全柜（BSC-1304IIA2）：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；自動(dòng)菌落成像分析系統(tǒng)（FLASH&GO）：西班牙IUL公司；氣相色譜儀（7890B）：安捷倫科技（中國(guó)）有限公司；全自動(dòng)生化分析儀（AU480）：貝克曼庫(kù)爾特商貿(mào)（中國(guó)）有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

BALB/c 5周齡小鼠[雄性，無(wú)特定病原體（specific pathogen free，SPF）級(jí)小鼠，體重為（20±2）g，許可證號(hào)SCXK（京）2016-0006]、滅菌動(dòng)物飼料、滅菌墊料：北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 菌株鑒定

實(shí)驗(yàn)所用擬桿菌均為健康人體糞便通過(guò)BHI擬桿菌選擇性培養(yǎng)基篩選獲得，為確保實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)前對(duì)-80℃保存的擬桿菌進(jìn)行菌株鑒定。

采用上游引物27F 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'、下游引物 1492R 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'[23]進(jìn)行菌株全長(zhǎng)16S rDNA序列PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，將瓊脂糖凝膠目的片段回收后對(duì)其16S rDNA進(jìn)行全長(zhǎng)測(cè)序。最后將拼接好的16S rDNA全長(zhǎng)序列在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）生物大分子序列比對(duì)搜索工具（basic local alignment search tool，Blast）核酸數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列的同源性比較。

1.4.2 擬桿菌耐酸能力測(cè)定

用鹽酸制備pH值為3.0的BHI液體培養(yǎng)基，采用比濁儀校正活化的接種菌液初始菌濃度，使其濃度達(dá)到0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)，取100 μL菌液接種于5 mL培養(yǎng)基中，置于37℃厭氧培養(yǎng)箱，于0、4 h進(jìn)行活菌平板計(jì)數(shù)，平行實(shí)驗(yàn)3次[24]。

1.4.3 混合抗生素誘導(dǎo)的偽無(wú)菌小鼠模型的建立

小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7d，按各組間平均體重?zé)o顯著差異重新分組，每組小鼠共10只。為滅活SPF小鼠腸道菌群，每隔12h用萬(wàn)古霉素（50mg/kg）、新霉素（100mg/kg）和甲硝唑（100 mg/kg）的混合溶液對(duì)小鼠灌胃1次，灌胃體積10 mL/kg；并在飲用水中加入氨芐青霉素（1 mg/mL）[20，25]。持續(xù)干預(yù) 7 d，每天采集小鼠糞便并監(jiān)測(cè)體重變化。

1.4.4 偽無(wú)菌小鼠模型有效性的檢驗(yàn)

1.4.4.1 稀釋涂布計(jì)數(shù)

將抗生素處理前和處理后小鼠糞便加入適量滅菌水均質(zhì)成懸浮液，10倍等梯度稀釋涂布于BHI固體培養(yǎng)基，厭氧手套箱37℃培養(yǎng)48 h，利用自動(dòng)菌落成像分析系統(tǒng)平板計(jì)數(shù)，將小鼠糞便活菌總數(shù)檢測(cè)限設(shè)定為1 CFU/mg定義為成功耗竭可培養(yǎng)腸道微生物[20]。

1.4.4.2 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

由于大多數(shù)腸道微生物不可培養(yǎng)[26]，還需通過(guò)16S rDNA基因qPCR估算糞便中細(xì)菌DNA的含量。使用糞便基因組DNA提取試劑盒提取抗生素處理前和處理后小鼠糞便中的DNA；按照J(rèn)imeno等[27]的方法進(jìn)行qPCR質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制作和獲得標(biāo)準(zhǔn)品的循環(huán)數(shù)閥值（cycle threshold value，CT值），通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)品的CT值與質(zhì)粒拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)作圖，生成標(biāo)準(zhǔn)曲線；按照實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒說(shuō)明采用熒光染料法在ABI 7900HT擴(kuò)增儀上得到糞便樣品的CT值，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算糞便樣品的16S rDNA拷貝數(shù)。

1.4.5 菌株移植

挑選4株耐酸性較強(qiáng)的擬桿菌進(jìn)行活化并富集，菌液6 000 r/min離心10 min后棄去上清液，再用少量滅菌生理鹽水重懸進(jìn)行濃縮，使菌液濃度達(dá)到109CFU/mL～1010CFU/mL，新鮮菌液灌胃給小鼠（10 mL/kg）。對(duì)照組灌胃滅菌生理鹽水。

擬桿菌定殖組分為B.koreensis組（Bacteroides koreensis YS-aM39定殖組）、B.thetaiotaomicron組（Bacteroides thetaiotaomicron JCM 5827定殖組）、B.salyersiae組（Bacteroides salyersiae JCM 12988定殖組）、B.vulgatus組（Bacteroides vulgatus ATCC 8482定殖組）。抗生素處理一周后，開(kāi)始進(jìn)行擬桿菌定殖，每天灌胃1次，共5 d。收集灌胃5 d后的小鼠糞便，稀釋涂布于BHI固體培養(yǎng)基上，37℃厭氧手套箱培養(yǎng)48 h，挑選形態(tài)一致且占平板絕大多數(shù)的菌落進(jìn)行菌株鑒定，檢驗(yàn)菌株是否定殖成功。

1.4.6 體重和臟器指數(shù)測(cè)定

小鼠每天稱(chēng)重，處死后取主要臟器（脾臟、腎臟、肝臟、心臟、胸腺）并用生理鹽水清洗，濾紙吸干水分后稱(chēng)量并記錄臟器質(zhì)量，用于計(jì)算臟器指數(shù)。

臟器指數(shù)/（mg/g）=臟器質(zhì)量（mg）/小鼠體重（g）

1.4.7 血清生化指標(biāo)測(cè)定

小鼠取血后，放置0.5h凝血后離心（4℃，3000r/min，15 min），分離血清置于-80℃冰箱保存。取80 μL小鼠血清加入160 μL生理鹽水進(jìn)行稀釋?zhuān)萌詣?dòng)血清生化儀測(cè)定谷丙轉(zhuǎn)氨酶、膽固醇、甘油三酯、谷草轉(zhuǎn)氨酶、血清總蛋白、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、血清白蛋白、尿酸、尿素、血糖含量。

1.4.8 盲腸內(nèi)容物短鏈脂肪酸含量測(cè)定

稱(chēng)取100 mg左右的小鼠糞便加入0.6 mL飽和磷酸鹽緩沖生理鹽水（pH7.3）和1 mmol/L內(nèi)標(biāo)（2-乙基丁酸）20 μL 勻漿，4℃，14 000 r/min，15 min離心取上清液過(guò)膜（0.22 μm 水系濾頭），取 200 μL上清液，加入0.1 mL 50%（體積分?jǐn)?shù)）硫酸溶液，加400 μL乙醚，渦旋后靜置2 min，取上清液測(cè)定[28]。根據(jù)短鏈脂肪酸（乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸）標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出糞便中短鏈脂肪酸的含量。

1.5 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用OriginPro 2021統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析處理，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，事后多重比較采用Tukey法，P＜0.05為有顯著差異；將對(duì)照組與擬桿菌定殖組、擬桿菌定殖組間的6種短鏈脂肪酸成分含量利用協(xié)方差矩陣標(biāo)準(zhǔn)化后進(jìn)行主成分分析（principal components analysis，PCA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株鑒定結(jié)果

實(shí)驗(yàn)所分離得到的6株擬桿菌16S rDNA全長(zhǎng)序列比對(duì)結(jié)果如表1所示。

表1 6株菌株16S rDNA序列比對(duì)結(jié)果Table 1 16S rDNA sequence alignment results of six Bacteroides

如表1所示，6種擬桿菌的16S rDNA全長(zhǎng)序列在NCBI核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)后，序列覆蓋度均為99%，序列同源性都在99%以上，可以認(rèn)定為同一種菌。

2.2 6株擬桿菌耐酸能力

觀察6株擬桿菌在pH3.0的環(huán)境下存活4 h的情況，結(jié)果如表2所示。

表2 6株擬桿菌在pH3.0處理?xiàng)l件下培養(yǎng)4 h的活菌存活率Table 2 Survival rate of viable bacteria of six species of Bacteroides cultured under pH3.0 treatment for 4 h

人體胃液中胃酸的主要成分為鹽酸，其pH值通常為3.0左右，只有具有良好耐酸能力的菌群可以通過(guò)胃酸屏障，以活菌形式到達(dá)腸道并發(fā)揮作用。如表2所示，Bacteroides koreensis YS-aM39存活率最高，Bacteroides vulgatus ATCC 8482、Bacteroides thetaiotaomicron JCM 5827和Bacteroides salyersiae JCM 12988存活率次之，這4種菌在酸性條件下培養(yǎng)4 h活菌存活率仍維持在10%以上，說(shuō)明這4種擬桿菌具有相對(duì)較好的耐酸能力；而B(niǎo)acteroides xylanisolvens XB1A、Bacteroides ovatus JCM 5824存活率較低，其中Bacteroides ovatus JCM 5824存活率不足1%，說(shuō)明該菌株的耐酸能力差。

綜合考慮這6種擬桿菌的耐酸能力及各菌株的特性，將 Bacteroides koreensis YS-aM39、Bacteroides thetaiotaomicron JCM 5827、Bacteroides salyersiae JCM 12988和Bacteroides vulgatus ATCC 8482作為擬桿菌定殖菌株。

2.3 偽無(wú)菌小鼠糞便涂布計(jì)數(shù)及實(shí)時(shí)熒光定量PCR

2.3.1 涂布計(jì)數(shù)

抗生素處理前后小鼠糞便活菌計(jì)數(shù)如表3所示。

表3 抗生素處理前后小鼠糞便活菌計(jì)數(shù)Table 3 Count of viable bacteria in mice feces before and after antibiotic treatment

由表3可知，抗生素處理前小鼠糞便中可培養(yǎng)活菌總數(shù)為（4.09±1.38）×105CFU/mg，而抗生素處理 7 d后，糞便中活菌總數(shù)極顯著性減少（P＜0.01），可培養(yǎng)活菌基本無(wú)檢出，但還未符合糞便活菌總數(shù)檢出限標(biāo)準(zhǔn)1 CFU/mg，實(shí)驗(yàn)結(jié)果能在一定程度上說(shuō)明混合抗生素處理建立偽無(wú)菌小鼠模型是可行的。

2.3.2 糞便DNA實(shí)時(shí)熒光定量

抗生素處理前后小鼠糞便中菌群總16S rDNA拷貝數(shù)如表4所示。

由表4可知，抗生素處理前后小鼠糞便菌群總16S rDNA拷貝數(shù)極顯著性減少（P＜0.01），下降了3個(gè)數(shù)量級(jí)，這相當(dāng)于減少了糞便中99.9%以上的細(xì)菌，且與Olson等[25]所建立的偽無(wú)菌小鼠模型DNA含量?jī)H降低400倍相比具有更好的效果。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果更有力地證明了混合抗生素處理建立偽無(wú)菌小鼠模型的可行性。

表4 抗生素處理前后小鼠糞便中菌群總16S rDNA拷貝數(shù)Table 4 Total 16S rDNA copy number of mice feces microbiota before and after antibiotic treatment

2.4 菌株定殖結(jié)果

菌株移植后收集各組小鼠糞便稀釋涂布于BHI培養(yǎng)基上，挑選形態(tài)一致且占平板絕大多數(shù)的菌落進(jìn)行菌株鑒定，16S rDNA全長(zhǎng)序列比對(duì)結(jié)果如表5所示。

表5 4株擬桿菌移植后小鼠糞便中主要菌種的序列比對(duì)結(jié)果Table 5 Sequence alignment results of main bacterial species in mice feces after transplantation of four Bacteroides

一般認(rèn)為16S rDNA序列同源性大于99%的定義為同種細(xì)菌，同源性介于95%～99%的界定為同屬的細(xì)菌[29]。如表5所示可知，B.thetaiotaomicron組和B.vulgatus組小鼠糞便主要菌株鑒定結(jié)果與其所移植菌Bacteroides thetaiotaomicron JCM 5827和Bacteroides vulgatus ATCC 8482序列覆蓋度達(dá)到100%，而且序列同源性也大于99%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果有力地證明了B.thetaiotaomicron組和B.vulgatus組菌株在小鼠體內(nèi)成功定殖。B.koreensis組序列覆蓋度為100%，序列同源性為96.53%（＜99%）；B.salyersiae組則是序列覆蓋度94%（＜98%）和序列同源性 95.22%（＜99%）都較低，說(shuō)明B.koreensis組和B.salyersiae組灌胃活菌未能成為小鼠腸道中的優(yōu)勢(shì)菌，菌株定殖結(jié)果相對(duì)較差。

2.5 4種擬桿菌的定殖對(duì)小鼠體重及臟器指數(shù)的影響

2.5.1 體重變化

4種擬桿菌的定殖對(duì)小鼠體重變化的影響如圖1所示。

圖1 4種擬桿菌的定殖對(duì)小鼠體重變化的影響Fig.1 The effect of colonization of four kinds of Bacteroides on the weight change of mice

第1天至第7天為抗生素處理，第8天至第12天為菌種移植，第13天至第21天為觀察期。如圖1所示，抗生素處理期間小鼠體重迅速下降，灌胃菌液之后體重下降速度減緩或維持穩(wěn)定，第11天后體重則開(kāi)始回升，逐漸恢復(fù)至正常的狀態(tài)。小鼠體重下降可能的原因一是抗生素處理的副作用，二是腸道菌的大量減少，缺少腸道菌群的輔助消化，腸道蠕動(dòng)減緩，能量吸收減少。在解剖抗生素處理小鼠時(shí)發(fā)現(xiàn)其盲腸較正常小鼠顯著變大且盲腸內(nèi)容物多呈液態(tài)，與無(wú)菌小鼠具有相似的特征[30]。對(duì)照組和擬桿菌定殖組體重變化趨勢(shì)基本相同，原因可能是在停止抗生素處理后，即使對(duì)照組沒(méi)有進(jìn)行菌種移植，但是SPF級(jí)動(dòng)物房的清潔程度與無(wú)菌級(jí)有較大差距，在實(shí)驗(yàn)操作中被外部環(huán)境所污染，腸道中有其它菌落的定殖。

2.5.2 臟器指數(shù)

4種擬桿菌對(duì)小鼠主要臟器指數(shù)的影響如表6所示。

表6 4種擬桿菌對(duì)小鼠主要臟器指數(shù)的影響Table 6 Effects of four Bacteroides on the main organ indexes of mice mg/g

如表6所示，除了肝臟指數(shù)擬桿菌定殖組B.salyersiae與對(duì)照組具有顯著性差異（P＜0.05）外，其他各組之間肝臟指數(shù)、心臟指數(shù)、腎臟指數(shù)、胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)均無(wú)顯著性差異（P＞0.05），說(shuō)明不同擬桿菌的定殖對(duì)主要臟器無(wú)顯著性影響。

2.6 4種擬桿菌的定殖對(duì)小鼠血清生化指標(biāo)的影響

4種擬桿菌定殖對(duì)小鼠血清生化指標(biāo)的影響如表7所示。

表7 4種擬桿菌定殖對(duì)小鼠血清生化指標(biāo)的影響Table 7 Effects of four Bacteroides colonization on serum biochemical indexes in mice

動(dòng)物的血清生化指標(biāo)，在一定程度上可以反映機(jī)體的整體代謝狀況，從生化指標(biāo)的異常變化可以推斷出某一組織或器官的功能狀況發(fā)生了改變。由表7可知，各組膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白、血糖含量及谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶活性無(wú)顯著差異（P＞0.05），與對(duì)照組、B.koreensis組相比，B.thetaiotaomicron、B.salyersiae、B.vulgatus組小鼠血清總蛋白含量顯著升高（P＜0.05）；與對(duì)照組、B.koreensis組相比，B.salyersiae、B.vulgatus組小鼠血清白蛋白含量顯著升高；與B.koreensis組相比，B.salyersiae、B.vulgatus組小鼠血清低密度脂蛋白含量顯著升高（P＜0.05）。此外，B.salyersiae組尿酸含量顯著低于B.vulgatus組，尿素含量顯著高于 B.thetaiotaomicron組（P＜0.05）。

對(duì)照組和擬桿菌定殖組B.koreensis較其它擬桿菌定殖組血清總蛋白和血清白蛋白含量稍低，血清總蛋白和白蛋白檢測(cè)是反映營(yíng)養(yǎng)狀況和肝臟功能的關(guān)鍵指標(biāo)[31-33]。對(duì)照組出現(xiàn)該情況的原因可能是與腸道菌群的缺失致使小鼠營(yíng)養(yǎng)吸收障礙和肝臟疾病等有關(guān)[34-36]，而B(niǎo).koreensis組出現(xiàn)此情況表明B.koreensis組所定殖的Bacteroides koreensis YS-aM39對(duì)小鼠營(yíng)養(yǎng)吸收和肝臟功能改善作用有限；有研究發(fā)現(xiàn)無(wú)菌小鼠的尿酸水平顯著高于正常小鼠與菌群移植小鼠[37]。高尿酸水平與痛風(fēng)高度關(guān)聯(lián)。B.salyersiae組尿酸含量低于其他實(shí)驗(yàn)組說(shuō)明Bacteroides salyersiae ATCC 8482的定殖可能對(duì)高尿酸人群具有一定的積極作用。

2.7 4種擬桿菌的定殖對(duì)小鼠盲腸內(nèi)容物短鏈脂肪酸含量的影響

4種擬桿菌的定殖對(duì)小鼠盲腸內(nèi)容物短鏈脂肪酸含量的影響如圖2所示。

如圖2所示，對(duì)照組的乙酸含量顯著高于B.koreensis、B.thetaiotaomicron 組（P＜0.01）；而丁酸含量顯著低于 B.koreensis、B.thetaiotaomicron、B.salyersiae、B.vulgatus組（P＜0.05）；異丁酸、戊酸含量顯著性地低于 B.thetaiotaomicron、B.salyersiae、B.vulgatus（P＜0.05）；異戊酸含量顯著低于B.thetaiotaomicron、B.salyersiae組（P＜0.05）。在擬桿菌定殖組 B.koreensis、B.thetaiotaomicron、B.salyersiae、B.vulgatus 中 ，B.salyersiae、B.vulgatus組的乙酸、丙酸和戊酸含量顯著高于B.koreensis組（P＜0.05）；B.thetaiotaomicron 組乙酸、異丁酸、戊酸和異戊酸含量顯著性高于B.koreensis組（P＜0.05）。

圖2 4種擬桿菌的定殖對(duì)小鼠盲腸內(nèi)容物短鏈脂肪酸含量的影響Fig.2 Effects of colonization of four kinds of Bacteroides on the content of short-chain fatty acids in the cecum of mice

對(duì)擬桿菌定殖組和對(duì)照組、擬桿菌定殖組間的6個(gè)短鏈脂肪酸成分含量進(jìn)行主成分分析，結(jié)果如圖3所示。

圖3a和圖3b主成分累計(jì)方差解釋率分別為76.4%、74.8%，說(shuō)明提取出來(lái)的兩個(gè)因子能夠較好地反映原數(shù)據(jù)的信息。從圖3a可以看出擬桿菌定殖組和對(duì)照組相比，具有較高的丁酸含量和較低的乙酸含量；而從圖3b可以看出，B.koreensis組與B.thetaiotaomicron、B.salyersiae、B.vulgatus組相比，具有較低的乙酸、丙酸和戊酸含量，但是差異較小。短鏈脂肪酸在維持腸道黏膜功能和完整性中發(fā)揮重要作用，尤其丁酸是結(jié)腸上皮細(xì)胞的重要能量底物，擬桿菌定殖組丁酸均顯著高于對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明擬桿菌的定殖對(duì)維持小鼠腸道健康具有積極的作用。

圖3 6種短鏈脂肪酸成分含量主成分分析Fig.3 Principal component analysis of six kinds of short-chain fatty acids

3 結(jié)論

本研究基于各種腸道菌的特性不同，利用混合抗生素處理建立偽無(wú)菌小鼠模型探討不同人源腸道擬桿菌對(duì)小鼠的干預(yù)作用。結(jié)果表明，利用高濃度的混合抗生素處理能殺死小鼠腸道99%的細(xì)菌；通過(guò)灌胃Bacteroides thetaiotaomicron JCM 5827和Bacteroides vulgatus ATCC 8482能較好地定殖腸道；不同擬桿菌的定殖對(duì)偽無(wú)菌小鼠的臟器指數(shù)無(wú)顯著影響；與其他擬桿菌定殖組相比Bacteroides salyersiae ATCC 8482定殖組血清中尿酸含量更低；與模型組相比，擬桿菌的定殖顯著性地增加了小鼠血清總蛋白、血清白蛋白和丁酸的含量，而較低的血清總蛋白、血清白蛋白含量與營(yíng)養(yǎng)吸收障礙有關(guān)，丁酸則在維持黏膜功能和完整性中發(fā)揮重要作用，研究結(jié)果說(shuō)明擬桿菌的定殖可能對(duì)改善菌群失調(diào)小鼠的營(yíng)養(yǎng)吸收和維持其腸道健康有積極的作用。

選擇性增加有益于人類(lèi)健康的腸道微生物是一類(lèi)新興的健康干預(yù)措施，但由于腸道菌群種類(lèi)豐富、與人體交互關(guān)系復(fù)雜，均要求研究人員對(duì)具體的腸道菌有透徹地了解，這樣才能在腸道菌群干預(yù)措施中獲得最佳效益，本研究結(jié)果可以為此提供一定的數(shù)據(jù)和理論支持。